本文關(guān)鍵詞：氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的實驗研究

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【摘要】：干眼是由于淚液的質(zhì)和(或)量或流體動力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和(或)眼表損害,從而導(dǎo)致眼部不適癥狀及視力障礙的一類疾病。是目前發(fā)病率最高的眼表疾病之一,但其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,目前認(rèn)為主要與炎癥、性激素水平失調(diào)、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制異常、細(xì)胞凋亡等因素相關(guān)。其中性激素在干眼的發(fā)病過程中起著重要的作用。近年研究表明雄激素在干眼癥發(fā)病機(jī)制中具有較為肯定的作用,能夠改善淚腺萎縮,促進(jìn)淚腺細(xì)胞增殖,緩解眼表損害,改善淚膜穩(wěn)定性,保護(hù)淚腺免于炎癥刺激。研究已證實雄激素受體存在于瞼板腺、淚腺以及角結(jié)膜等處。氟他胺為非甾體類抗雄激素藥物,除抗雄激素作用外,本品無任何激素的作用。其代謝產(chǎn)物小羥基氟他胺是主要活性形式,能在靶組織內(nèi)與雄激素受體結(jié)合,阻斷二氫睪丸酮(雄激素的活性形式)與雄激素受體結(jié)合,抑制靶組織攝取睪酮,從而起到抗雄激素作用。干眼動物模型是研究干眼發(fā)病、發(fā)展的重要手段,根據(jù)干眼不同的發(fā)病機(jī)制建立合適的動物模型是實驗研究的基礎(chǔ),但未見使用雄激素受體拮抗劑制作干眼模型的報道。炎癥在干眼病的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色,但是國內(nèi)外有關(guān)應(yīng)用抗雄激素藥物導(dǎo)致的干眼癥與眼表炎癥因子關(guān)系的研究較少。因此,本研究擬通過制作雄激素受體拮抗劑氟他胺誘導(dǎo)的大鼠干眼模型,觀察大鼠淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性、眼表組織病理學(xué)變化；通過免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α, IL-1α)在角膜、結(jié)膜、淚腺和瞼板腺上皮的表達(dá),探討雄激素受體拮抗劑氟他胺導(dǎo)致干眼的發(fā)病機(jī)制,分析該模型的科學(xué)性及實用性,并為干眼的治療提供理論依據(jù)。第一部分氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的建立目的建立雄激素受體拮抗劑氟他胺誘導(dǎo)的大鼠干眼動物模型,為進(jìn)一步探討雄激素在干眼發(fā)病機(jī)制中的作用提供基礎(chǔ)。方法清潔級健康成年SD雌性大鼠32只,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為高濃度組、中濃度組、低濃度組和對照組,每組各8只。高、中、低濃度組分別用濃度為16mg·kg-1·d-1、13mg·kg-1·d-1、10mg·kg-1·d-1氟他胺溶液灌胃,對照組1ml·d-1生理鹽水灌胃,每組分別于給藥前和給藥后2、4、8、16、20周測干眼臨床指標(biāo)：淚液分泌試驗(Schirmer I test, S I t)、淚膜破裂時間(tear firm break-up time, BUT)及角膜熒光素鈉染色評分。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：給藥后20周時高、中、低濃度組大鼠的干眼臨床指標(biāo)與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。每組分別于給藥前、給藥后10、20周行心臟穿刺取血,采用放射免疫法測量血清睪酮及雌二醇濃度。使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件數(shù)據(jù)分析,描述性統(tǒng)計值用X±S表示,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1. Schirmer I test:給藥后4周時高濃度組(8.20±0.58mm)、中濃度組(8.53±0.34mm) S I t值開始減少,與對照組(9.84±0.54mm)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；8周時高濃度組(7.13±0.25mm)、中濃度組(7.04±0.47mm)、低濃度組(8.43±0.67mm)的SIt值均少于對照組(9.94±0.43mm)(P0.05)；隨著時間延長,20周時高濃度組(3.23±0.31mm)、中濃度組(3.98±0.36mm)、低濃度組(4.73±0.18mm)的SIt值進(jìn)一步減少,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且均較對照組(9.60±0.60mm)下降大于50%(P0.05)。2.BUT：給藥后4周時高濃度組(6.80±1.05s)大鼠即出現(xiàn)BUT縮短,分別與低濃度組(8.63±0.65s)、對照組(9.25±1.03s)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；8周時,高濃度組(5.20±0.58s)、中濃度組(7.21±0.56s)、低濃度組(8.32±0.37s)的BUT兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且均短于對照組(10.70±1.07s)(P0.05)；20周時高(2.40±0.61 s)、中(4.32±0.68s)、低(6.10±0.81s)濃度組的BUT較對照組(9.12±0.73s)進(jìn)一步縮短,各組之間兩兩比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.角膜熒光素鈉染色：給藥后4周時高、中濃度組開始出現(xiàn)角膜上皮點(diǎn)狀熒光素鈉著色；8周時角膜熒光素鈉染色評分高濃度組(6.80±0.79)、中濃度組(4.13±0.53)分別與低濃度組(2.50±1.08)、對照組(0.56±1.30)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；16周時高濃度組可見彌漫性大片狀著色,中、低濃度組角膜上皮出現(xiàn)小片狀著色,隨時間延長高、中、低濃度組角膜熒光素鈉染色評分逐漸加重,20周時高濃度組(9.05±0.49)、中濃度組(7.21±0.57)、低濃度組(4.82±0.47)、對照組(1.05±1.13)染色評分兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.性激素水平：給藥后10周時高濃度組(4.38±0.68pg·ml-1)、中濃度組(3.56±0.53pg·ml-1)的血清睪酮濃度開始升高,分別與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；20周時高濃度組(5.08±0.21pg·ml-1)、中濃度組(4.23±0.16pg·ml-1)、低濃度組3.58±0.24pg·ml-1)血清睪酮濃度較對照組(2.24±0.15pg·ml-1)不同程度升高,兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。給藥后10、20周時高、中、低濃度組血清雌二醇濃度較對照組均無明顯差異(P0.05),各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論雄激素受體拮抗劑氟他胺溶液灌胃可以成功建立混合型干眼模型,且干眼的嚴(yán)重程度呈時間和藥物濃度依賴性。第二部分氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的機(jī)制研究目的探討氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的作用機(jī)制。方法實驗動物及分組同第一部分。20周后麻醉下處死各組動物,取角膜、結(jié)膜、淚腺和瞼板腺組織HE染色觀察各上皮病理組織變化,并采用免疫組織化學(xué)方法檢測’TNF-α、IL-1α在各組織上皮的表達(dá)。每張切片選取5個200倍視野進(jìn)行拍照,并用Image-Pro Plus分析軟件對照片進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件數(shù)據(jù)分析,描述性統(tǒng)計值用X±S表示,TNF-α、IL-1α的表達(dá)量用單因素方差分析(One-Way ANOVA), P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.角膜組織病理學(xué)觀察：高、中、低濃度組角膜出現(xiàn)不同程度鱗狀上皮層次明顯增加,排列紊亂且可見表層細(xì)胞不規(guī)則缺失,翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞排列紊亂,基質(zhì)層水腫,高濃度組病變最顯著。對照組角膜上皮細(xì)胞層次正常較扁平,表層細(xì)胞不角化,翼狀上皮細(xì)胞呈多角形,基底細(xì)胞排列整齊。2.淚腺組織病理學(xué)觀察：高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度淚腺上皮細(xì)胞扁平萎縮小而密集、胞漿淡染,可見空泡,細(xì)胞排列紊亂,腺腔擴(kuò)大。腺泡萎縮融合,大小不一,結(jié)構(gòu)排列紊亂,高濃度組改變最為顯著。對照組可見結(jié)締組織深入實質(zhì)將腺組織分割成小葉,邊界清晰而規(guī)則的腺泡細(xì)胞大小均勻,內(nèi)層是柱狀上皮細(xì)胞,核位于基底部。3.結(jié)膜組織病理學(xué)觀察：高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度結(jié)膜上皮細(xì)胞層數(shù)增多,層次間模糊,排列紊亂呈角化狀,基底層細(xì)胞排列不整齊,可見炎性細(xì)胞浸潤。對照組結(jié)膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則,無角化及炎性細(xì)胞浸潤。4.瞼板腺組織病理學(xué)觀察：高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度險板腺腺體萎縮融合,鱗狀上皮化生,腺管壁增厚,基底細(xì)胞變薄,腺管周圍纖維化和腺管開口擴(kuò)張。對照組險板腺可見邊界清晰而規(guī)則的腺細(xì)胞,大小均勻排列整齊,腺管呈一同心圓狀,管壁厚度正常。6.角膜中TNF-α、IL-1α的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-la大量表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞胞漿及少量表達(dá)于基質(zhì)層,對照組微量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個角膜上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P0.05)。高、中濃度組角膜上皮TNF-α、IL-1α的陽性細(xì)胞數(shù)相對低濃度組較高(P0.05)。7.淚腺中TNF-α、IL-1α的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示高、中濃度組TNF-α、IL-la大量表達(dá)于淚腺腺泡上皮細(xì)胞胞漿,低濃度組可見中量表達(dá),對照組少量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個淚腺細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P0.05)。高、中濃度組淚腺上皮TNF-α的陽性細(xì)胞數(shù)相對低濃度組較高(P0.05),但高、中濃度組間比較,差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。高、中、低濃度組的IL-1α陽性細(xì)胞計數(shù)組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。8.瞼板腺中TNF-α、IL-1α的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1a大量表達(dá)于瞼板腺腺泡細(xì)胞胞漿,對照組少量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個瞼板腺腺泡細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P0.05)。高、中濃度組TNF-α、IL-1α的陽性細(xì)胞計數(shù)相對低濃度組較高(P0.05),但高、中濃度組間比較,差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。9.結(jié)膜中TNF-α、IL-1α的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-la大量表達(dá)于結(jié)膜上皮細(xì)胞胞漿,微量表達(dá)于固有層,對照組少量表達(dá)于結(jié)膜上皮細(xì)胞胞漿。高、中、低濃度組每1000個結(jié)膜上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P0.05)。高、中、低濃度組TNF-α的陽性細(xì)胞計數(shù)組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。高濃度組IL-1α的陽性細(xì)胞計數(shù)相對低濃度組較高(P0.05),但高、中濃度組以及中、低濃度組間比較,差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論1.氟他胺能引起大鼠角膜、淚腺、瞼板腺、結(jié)膜組織的病理學(xué)改變,且病理改變程度與給藥濃度呈正相關(guān)。2.氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼與TNF-α、IL-1α在角膜、淚腺、瞼板腺、結(jié)膜組織的表達(dá)增加有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R777.34

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本文編號：1152572