本文關(guān)鍵詞：人C-反應(yīng)蛋白（CRP）基因的克隆及表達(dá)研究

  更多相關(guān)文章： C-反應(yīng)蛋白(CRP) 桿狀病毒 家蠶 多克隆抗體 Western Blot

【摘要】：C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)參與人體炎癥反應(yīng),是臨床診斷中的重要檢測(cè)指標(biāo)。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)有高效表達(dá)和翻譯后修飾的功能,可規(guī)�；a(chǎn),是外源重組蛋白理想的表達(dá)系統(tǒng),本研究嘗試?yán)迷撓到y(tǒng)表達(dá)重組人CRP蛋白。通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物,以人的肝組織c DNA為模板,擴(kuò)增CRP目的基因,連接到p ColdTMII載體上,構(gòu)建了重組p ColdTMII-CRP表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中,誘導(dǎo)工程菌獲得包涵體蛋白,經(jīng)包涵體溶解,Ni-NTA柱純化,復(fù)性得到原核表達(dá)的重組人CRP蛋白,經(jīng)過(guò)SDS-PAGE,Western Blot鑒定,以及質(zhì)譜分析可以確定蛋白成功表達(dá)。以原核表達(dá)的重組人CRP為抗原,免疫新西蘭大耳兔,首次以弗氏完全佐劑免疫,一周后以弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫,每周一次連續(xù)免疫四周,最后一次免疫前ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià),達(dá)到目的效價(jià)一周后頸動(dòng)脈取兔全血,離心得抗CRP血清,ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)在抗原濃度10μg/m L時(shí)抗血清效價(jià)達(dá)到1:64000。得到CRP多克隆抗體,Western Blot檢測(cè)得到目的條帶,可用于后續(xù)的研究中。PCR得到CRP目的基因,酶切連接到p Fast BacTMHTB轉(zhuǎn)移載體,得到重組p Fast BacTMHTB-CRP轉(zhuǎn)移載體,利用Bac-to-Bac系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到E.coli Bm DH10Bac中,篩選出重組Bacmind-CRP。轉(zhuǎn)染Bm N細(xì)胞,5 d左右細(xì)胞發(fā)病,得到重組桿狀病毒v Bm His-CRP。擴(kuò)增病毒接種到家蠶Bm N細(xì)胞中,并穿刺接種五齡的家蠶幼蟲(chóng),在家蠶Bm N細(xì)胞和五齡的家蠶幼蟲(chóng)中均檢測(cè)到目的蛋白。為獲得廉價(jià)的重組產(chǎn)物,故選擇在家蠶體內(nèi)表達(dá),SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)蛋白,發(fā)現(xiàn)重組人CRP蛋白在沉淀中,引入信號(hào)肽的重組病毒同樣表達(dá)包涵體,因此按照純化大腸桿菌包涵體的辦法純化家蠶體內(nèi)的重組人CRP蛋白,得到目的蛋白,表達(dá)產(chǎn)量略低且有少許雜蛋白。用自制的CRP多克隆抗體Western Blot檢測(cè)得到目的條帶,質(zhì)譜檢測(cè)確定該蛋白為重組人CRP蛋白。這為家蠶生物反應(yīng)器規(guī)�；苽渲亟M人CRP蛋白打下了基礎(chǔ),解決了臨床CRP相關(guān)炎癥反應(yīng)快速診斷試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)抗原的來(lái)源問(wèn)題。
【關(guān)鍵詞】：C-反應(yīng)蛋白(CRP) 桿狀病毒 家蠶 多克隆抗體 Western Blot
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 縮略語(yǔ)8-13
• 第一章 緒論13-18
• 1 C-反應(yīng)蛋白的概念13-14
• 1.1 C-反應(yīng)蛋白（CRP）的發(fā)現(xiàn)和命名13
• 1.2 CRP的生物化學(xué)和生理學(xué)特性13-14
• 2 CRP的疾病相關(guān)性研究14-17
• 2.1 CRP蛋白與腦血管疾病相關(guān)性研究14
• 2.2 CRP蛋白與中風(fēng)相關(guān)性研究14-15
• 2.3 CRP蛋白與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究15-16
• 2.4 CRP蛋白與主動(dòng)脈壁內(nèi)血腫的相關(guān)性研究16
• 2.5 CRP與晚發(fā)阿爾茲海默癥相關(guān)性研究16
• 2.6 CRP與肺炎的相關(guān)研究16-17
• 3 家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研究17-18
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)18-20
• 1 研究目的及意義18
• 2 研究?jī)?nèi)容18-19
• 3 實(shí)驗(yàn)流程圖19-20
• 第三章 人CRP基因的生物信息學(xué)分析20-24
• 1 序列和工具20
• 1.1 序列20
• 1.2 生物信息學(xué)工具20
• 2 人CRP蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果20-23
• 2.1 人CRP蛋白的基因序列20
• 2.2 人CRP蛋白信號(hào)肽分析20-21
• 2.3 人CRP蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)21
• 2.4 人CRP蛋白疏水性分析21-22
• 2.5 人CRP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)22-23
• 2.6 人CRP蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)23
• 3 討論23-24
• 第四章 人CRP基因的克隆、原核表達(dá)與純化24-36
• 1 材料與試劑24-25
• 1.1 材料24
• 1.2 試劑24
• 1.3 試劑配制24-25
• 2 方法25-31
• 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建25-29
• 2.2 重組質(zhì)粒pColdTM II-CRP在BL21(DE3)中表達(dá)29-30
• 2.3 CRP融合蛋白純化30
• 2.4 BCA法蛋白定量30-31
• 2.5 CRP的質(zhì)譜檢測(cè)31
• 3 結(jié)果31-35
• 3.1 PCR擴(kuò)增人CRP基因31
• 3.2 重組pBluescript II SK(+)-CRP的菌落PCR鑒定31-32
• 3.3 重組質(zhì)粒pColdTM II-CRP的菌落PCR鑒定32
• 3.4 重組CRP的原核表達(dá)32-33
• 3.5 親和層析純化重組蛋白33-34
• 3.6 原核表達(dá)CRP蛋白樣品濃度34
• 3.7 質(zhì)譜分析結(jié)果34-35
• 4 討論35-36
• 第五章 人CRP蛋白多克隆抗體的制備36-40
• 1 材料和試劑36
• 1.1 材料36
• 1.2 試劑36
• 2 制備方法36-38
• 2.1 免疫抗原的制備36
• 2.2 動(dòng)物免疫36-37
• 2.3 制備兔多克隆抗血清37
• 2.4 ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)37
• 2.5 Western Blot檢測(cè)抗體的特異性37-38
• 3 結(jié)果38-39
• 3.1 多克隆抗體的效價(jià)38
• 3.2 Western Blot檢測(cè)結(jié)果38-39
• 4 討論39-40
• 第六章 家蠶桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)人C-反應(yīng)蛋白40-54
• 1 材料與試劑40
• 1.1 材料40
• 1.2 試劑40
• 2 方法40-47
• 2.1 構(gòu)建pFastBacTMHTB-CRP重組載體40-41
• 2.2 重組質(zhì)粒與Bacmid同源重組41-43
• 2.3 重組病毒vBmHis-CRP的構(gòu)建43-45
• 2.4 重組人CRP蛋白在家蠶BmN細(xì)胞中的表達(dá)和鑒定45
• 2.5 重組人CRP蛋白在家蠶五齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)及鑒定45-46
• 2.6 五齡蠶體內(nèi)CRP融合蛋白的純化46
• 2.7 BCA法蛋白定量46
• 2.8 重組CRP的質(zhì)譜檢測(cè)46-47
• 3 結(jié)果47-53
• 3.1 擴(kuò)增CRP基因片段結(jié)果47
• 3.2 重組質(zhì)粒的菌落PCR47-48
• 3.3 重組Bacmid DNA PCR鑒定48-49
• 3.4 重組病毒vBmHis-CRP鑒定結(jié)果49
• 3.5 家蠶細(xì)胞中表達(dá)重組人CRP蛋白的結(jié)果49-51
• 3.6 家蠶蠶體中重組人CRP蛋白的鑒定結(jié)果51
• 3.7 家蠶體內(nèi)重組人CRP蛋白的純化和定量51-52
• 3.8 純化的重組蛋白質(zhì)譜檢測(cè)分析52-53
• 4 討論53-54
• 小節(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 致謝58

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 譚淑敏;李杰;王小飛;舒特俊;陳劍清;張耀洲;于威;;人血清對(duì)氧磷酶1在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及活性檢測(cè)[J];蠶業(yè)科學(xué);2014年03期

2 潘晶晶;潘華曄;嚴(yán)珍珍;葉甫云;張耀洲;呂正兵;;利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)葡萄白藜蘆醇芪合酶基因[J];藥物生物技術(shù);2014年02期

3 閆晶晶;張耀洲;陳劍清;于威;舒特俊;;家蠶桿狀病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究[J];浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào);2014年11期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 閆晶晶;家蠶桿狀病毒表面展示SARS-CoV N、RBD蛋白及其免疫原性研究[D];浙江理工大學(xué);2014年

2 梅文楓;PCR產(chǎn)物快速構(gòu)建重組桿狀病毒的方法及相關(guān)功能蛋白的研究[D];浙江理工大學(xué);2014年

3 趙文年;小反芻獸疫西藏07株H、F、M、P蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1065536