本文關(guān)鍵詞：HuR和miR-890轉(zhuǎn)錄后調(diào)控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質(zhì)ICAM-1、HMGB1的機(jī)制研究

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【摘要】：急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是常見臨床危重癥,治療手段缺乏。嚴(yán)重感染和創(chuàng)傷等多種誘因?qū)е录?xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion Molecule 1, ICAM-1)、高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein 1, HMGB1)大量釋放,形成炎癥風(fēng)暴,活化多種炎癥細(xì)胞,進(jìn)而誘導(dǎo)更多炎癥因子釋放,形成失控的級(jí)聯(lián)放大式炎癥反應(yīng),最后導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞在肺部聚集和活化、血管內(nèi)皮和氣道上皮屏障水腫、增厚、破壞。在發(fā)生ARDS時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞表面的ICAM-1表達(dá)增多,導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞在肺部浸潤、血管通透性增加,促進(jìn)急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)展。HMGB1作為內(nèi)源性信號(hào)分子,又稱為損傷相關(guān)分子模式(Danger associated molecular pattern, DAMP)是一種重要的警報(bào)素,參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促炎作用。雖然ICAM-1、HMGB1的異常表達(dá)參與急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生,但其調(diào)控機(jī)制仍不明確。RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)和microRNA是兩種常見的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式,可通過結(jié)合在mRNA的3’端非翻譯區(qū)調(diào)控基因表達(dá)。ICAM-1和HMGB1的3’端非翻譯區(qū)均存在RNA結(jié)合蛋白HuR可以作用的AU元件。此外,不同誘因?qū)е翧RDS患者外周血中microRNA譜發(fā)生顯著變化,生物信息學(xué)預(yù)測表明miR-890與HMGB1存在結(jié)合可能性。但HuR和miR-890對(duì)呼吸窘迫綜合征兩種重要的炎癥介質(zhì)ICAM-1和HMGB1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本研究探索HuR和miR-890轉(zhuǎn)錄后調(diào)控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質(zhì)ICAM-1、HMGB1的機(jī)制,將為臨床防治多種誘因?qū)е碌腁RDS提供通用治療靶點(diǎn)。第一部分HuR轉(zhuǎn)錄后調(diào)控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質(zhì)ICAM-1機(jī)制研究目的：探討p38-MAPK-MK2-HuR途徑是否參與了TNF-α誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin及IL-8,是否進(jìn)而影響中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。方法：收集ARDS患者外周血,檢測血清中粘附因子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表達(dá)量；體外培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,給予TNF-α刺激,檢測HuR蛋白和ICAM-1 mRNA結(jié)合情況：通過MK2-pcDAN3.1(+)和HuR-pcDAN3.1(+)質(zhì)粒上調(diào)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MK2.HuR蛋白表達(dá)后,給予TNF-α刺激,檢測MK2、HuR、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-8 mRNA和蛋白表達(dá)水平；觀察HuR細(xì)胞內(nèi)定位情況；觀察健康人外周血分離的中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附情況。本實(shí)驗(yàn)用到的實(shí)驗(yàn)方法有電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀、蛋白印跡、細(xì)胞漿-胞核蛋白提取、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附,實(shí)時(shí)定量PCR和放線菌素D實(shí)驗(yàn)及中性粒細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：46例ARDS患者外周血中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表達(dá)增高；電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀證實(shí)HuR與ICAM-1 mRAN 3'UTR區(qū)域相結(jié)合;蛋白印跡和免疫熒光結(jié)果顯示MK2促進(jìn)了胞漿中HuR聚集,對(duì)胞核HuR表達(dá)無影響；HuR高表達(dá)增加了]NF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá),但對(duì)E-selectin和IL-8釋放無影響：HuR提高了ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平和穩(wěn)定性,但對(duì)E-selectin和IL-8 mRNA水平和穩(wěn)定性無影響：HuR高表達(dá)增強(qiáng)了中性粒細(xì)對(duì)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附功能。結(jié)論：ARDS患者外周血sICAM-1、sVCAM-1和E-selectin表達(dá)增高。MK2通過改變HuR亞細(xì)胞定位調(diào)控粘附因子ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)；HuR通過與ICAM-1 mRAN 3'UTR區(qū)域相結(jié)合,增加ICAM-1 mRNA穩(wěn)定性,促進(jìn)ICAM-1蛋白表達(dá),從而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對(duì)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用；但HuR對(duì)E-selectin和IL-8釋放無影響。第二部分miR-890轉(zhuǎn)錄后調(diào)控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質(zhì)HMGB1的機(jī)制研究目的：探究miR-890轉(zhuǎn)錄后調(diào)控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質(zhì)HMGB1的機(jī)制。方法：收集肺部感染、腹腔感染和胰腺炎等所致ARDS患者外周血,行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測HMGB1水平；將3例肺部感染所致ARDS及健康對(duì)照者血清,通過Affymetrix microRNA 4.0 Array芯片檢測人源2578種microRNA表達(dá),得到差異性變化microRNA。將上述表達(dá)存在顯著差異的microRNA分別通過Target Scan Human、miRanda和RNA22 v2 microRNA target detection 3個(gè)在線靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測,得到其中可能與HMGB1存在潛在結(jié)合位點(diǎn)的microRNA。結(jié)合Target Scan及miRanda預(yù)測數(shù)據(jù)庫Context score分值排名,采用排名位于前3名的microRNA與HMGB1質(zhì)粒行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),篩選出能抑制HMGB1表達(dá)的microRNA,并在46例ARDS患者血清中進(jìn)一步擴(kuò)大驗(yàn)證其表達(dá)含量;同時(shí),在LPS刺激的內(nèi)皮細(xì)胞系(肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、肺泡上皮細(xì)胞系(HBE、A549)中驗(yàn)證該microRNA表達(dá)情況。在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中給予microRNA模擬物,驗(yàn)證是否能調(diào)控HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)：給予上述條件下,給予細(xì)胞LPS刺激,檢測炎癥因子、趨化因子、粘附因子及TLR2、TLR4信號(hào)通路表達(dá)情況。行電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HuR與HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域是否結(jié)合。結(jié)果：46例ARDS患者外周血清中HMGB1水平明顯升高；肺部感染所致ARDS患者血清microRAN芯片檢測結(jié)果示,45種microRNA在肺部感染所致ARDS患者與成年健康人血清中呈現(xiàn)顯著差異性表達(dá)。miR-890為下調(diào)的microRNA,下調(diào)0.48倍。LPS刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞后,細(xì)胞中miR-890水平降低。3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測microRNA與HMGB1結(jié)合情況,13種microRNA有可能與HMGB1 mRNA結(jié)合。結(jié)合Target Scan、miRanda、RNA22數(shù)據(jù)庫預(yù)測情況,miR-890、miR-106a-3p和miR-140-3p.1這三種miRNA與HMGB1 mRNA3'UTR結(jié)合的可能性排名靠前。行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果示3種microRNA中僅miR-890 mimics轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后致使熒光素酶活性降低。對(duì)HPMEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-890mimics能抑制HMGB1蛋白及mRNA表達(dá);給予LPS刺激后,miR-890 mimics轉(zhuǎn)染組炎癥因子IL-1β、IL-6、L-8、TNF-α,趨化因子MCP-1、RNATES,粘附因子ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組減少,TLR2、TLR4信號(hào)通路激活減少。HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域多處存在AU序列,電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)示HuR可與HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域結(jié)合。結(jié)論：ARDS患者血清中循環(huán)miR-890水平明顯降低；LPS刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞后,細(xì)胞中miR-890水平降低：miR-890通過與HMGB1 3'UTR區(qū)域結(jié)合,抑制HMGB1 mRNA及蛋白分子表達(dá),在LPS刺激時(shí)削弱炎癥因子、趨化因子、粘附因子表達(dá),TLR2、 TLR4信號(hào)通路激活減少。HuR通過與HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域結(jié)合,穩(wěn)定HMGB1 mRNA3’UTR,與miR-890起到競爭作用。
【關(guān)鍵詞】：HuR ICAM-1 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 中性粒細(xì)胞粘附 MK2 p38 MAPK HMGB1 miR-890 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 炎癥
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563.8
【目錄】：

• 中英文縮略詞表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-15
• 緒論15-24
• References20-24
• 第一部分 HuR轉(zhuǎn)錄后調(diào)控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質(zhì)ICAM-1的機(jī)究研究24-72
• 引言24-32
• 一、材料與方法32-51
• 二、結(jié)果51-63
• 三、討論63-65
• 四、結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 第二部分 miR-890轉(zhuǎn)錄后調(diào)控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質(zhì)HMGB1的機(jī)制研究72-110
• 引言72-77
• 一、材料與方法77-87
• 二、結(jié)果87-101
• 三、討論101-104
• 四、結(jié)論104-105
• 參考文獻(xiàn)105-110
• 全文總結(jié)110-111
• 附錄111-141
• 一、研究綜述文章111-136
• References122-136
• 二、試劑配制136-139
• 三、引物與探針序列139-140
• 四、博士期間完成文章列表140-141
• 致謝141-142

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本文編號(hào)：987243