本文關(guān)鍵詞：支架蛋白GABs調(diào)控過敏性哮喘的病理生理學(xué)意義

  更多相關(guān)文章： Gab1 Gab2 過敏性哮喘 氣道上皮細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞

【摘要】：哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病,其主要特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作,伴有可逆的氣流阻塞和支氣管痙攣,主要臨床病理表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性、黏液的過度分泌和以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥。有多種細(xì)胞特別是氣道上皮、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等參與其發(fā)病過程。哮喘的發(fā)病是由遺傳因素和環(huán)境因素(如過敏原,呼吸道病毒感染等)共同參與調(diào)控的,目前為止并無(wú)可以治愈哮喘的藥物。研究哮喘的發(fā)病過程及其具體調(diào)控機(jī)制對(duì)于該疾病的預(yù)防和治療具有非常重要的意義。 可逆磷酸化是普遍存在的蛋白翻譯后修飾方式,由激酶及磷酸酶家族蛋白行使可逆酶促反應(yīng)構(gòu)成了細(xì)胞信號(hào)調(diào)控的化學(xué)本質(zhì),近年來(lái)許多研究提示支架蛋白(或錨定蛋白)雖不具有催化功能結(jié)構(gòu)域,但與激酶與磷酸酶相互作用,在磷酸化信號(hào)的組織特異性與精細(xì)的時(shí)序調(diào)控發(fā)揮至關(guān)重要的作用。GAB蛋白家族(Grb2-associated binder)是一類生物體廣泛存在的支架蛋白。Gab1和Gab2在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá),主要由PH(pleckstrin homologue)結(jié)構(gòu)域,酪氨酸基序,脯氨酸富集區(qū)構(gòu)成。GABs本身并無(wú)酶活,它們的主要作用是在細(xì)胞信號(hào)傳遞過程中招募多種接頭蛋白或酶分子(包括酪氨酸激酶和磷酸酶),完成信號(hào)的傳遞,進(jìn)而參與了多種胞外刺激引發(fā)的信號(hào)通路,介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、極化等多種重要的生理過程。之前的研究認(rèn)為支架蛋白Gab1和Gab2存在代償和功能冗余的現(xiàn)象,但近年來(lái)越來(lái)越多的研究提示Gab1和Gab2功能存在組織特異性和差異性。近年來(lái)一項(xiàng)大規(guī)模的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)gab1是哮喘的一個(gè)新的易感基因,然而其在哮喘及過敏性炎癥中的功能及其調(diào)控機(jī)制尚未報(bào)道。我們首先發(fā)現(xiàn)患有哮喘的小鼠外周血單核細(xì)胞中Gab1的表達(dá)顯著增高,而Gab2的表達(dá)沒有顯著性變化,Gab2的表達(dá)是在哮喘小鼠的氣道上皮中呈現(xiàn)了顯著性的升高。同時(shí)在哮喘病人外周血(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象,提示Gab1、Gab2可能都參與了哮喘過敏性炎癥過程,然而其調(diào)控機(jī)制存在差異�；诖�,我們構(gòu)建了Gab1KO的小鼠(LysmCre-Gab1flox/flox,髓系來(lái)源單核細(xì)胞Gab1條件性敲除).同時(shí)利用Gab2-/-的小鼠研究這兩個(gè)蛋白在過敏哮喘中的病理與病理生理學(xué)意義。 首先我們研究發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞中缺失Gab2會(huì)導(dǎo)致IL-13誘導(dǎo)的黏液蛋白分泌的減少,同時(shí)利用雞卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導(dǎo)哮喘模型的Gab2-/-小鼠表現(xiàn)氣道黏液分泌降低,進(jìn)而緩解氣道炎癥的遺傳學(xué)表型。PI3K/AKT、 IL-13/TYK2/STAT6信號(hào)在調(diào)控氣道上皮黏液分泌過程中具有關(guān)鍵性意義。后續(xù)機(jī)制的研究進(jìn)一步顯示Gab2參與了正向調(diào)控IL-13/TYK2/STAT6通路,Gab2能夠與TYK2/STAT6通路的負(fù)反饋調(diào)控因子SOCS3競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TYK2上,因此當(dāng)Gab2在氣道上皮中缺失后,會(huì)導(dǎo)致更多的SOCS3結(jié)合到TYK2上,從而促進(jìn)了TYK2的泛素化降解,使得STAT6的磷酸化顯著低于正常水平,從而正向調(diào)控了氣道上皮的黏液分泌。 同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)Gab1在髓系來(lái)源細(xì)胞的缺失會(huì)導(dǎo)致OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘緩解,主要表現(xiàn)為包括Th2型炎癥因子的浸潤(rùn)減少,以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)減少,杯狀細(xì)胞的化生和黏液分泌的減少。通過過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),證實(shí)了樹突狀細(xì)胞(dentritic cell, DC)中Gab1的缺失影響了樹突狀細(xì)胞的功能導(dǎo)致了哮喘的緩解,排除了巨噬細(xì)胞(macrophage)中Gab1缺失的影響。后續(xù)的研究顯示Gab1正向調(diào)控了CCL19介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞向淋巴結(jié)的遷移進(jìn)而阻礙了DCs將加工處理好的抗原提呈給T細(xì)胞,最終阻斷了獲得性免疫的開啟,緩解過敏性哮喘。 基于以上研究,我們認(rèn)為支架蛋白Gab1和Gab2作為支架蛋白GABs家族中最主要的兩類蛋白,在過敏性哮喘中發(fā)揮著不同的精細(xì)調(diào)控作用,Gab1通過影響樹突狀細(xì)胞的遷移影響過敏性哮喘的病理過程,Gab2正向調(diào)控了氣道上皮的化生和黏液分泌過程。該研究可以幫助更好地理解過敏性哮喘的病理過程,并為該疾病的診斷治療提供新的潛在靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：Gab1 Gab2 過敏性哮喘 氣道上皮細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

• 致謝5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 英文縮略詞表13-19
• 第一章 ：支架蛋白Gab2介導(dǎo)TYK2/STAT6通路調(diào)控氣道上皮黏液的分泌和杯狀細(xì)胞的化生19-59
• 1. 引言19-22
• 2. 材料和試劑22-26
• 2.1 主要儀器22-23
• 2.2 主要試劑耗材23-25
• 2.3 小鼠25
• 2.4 細(xì)胞25-26
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法26-35
• 3.1 免疫組化26
• 3.2 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染26-27
• 3.3 質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染27-28
• 3.4 細(xì)胞RNA提取(Trizol法)及熒光定量PCR28
• 3.5 細(xì)胞免疫熒光28-29
• 3.6 小鼠哮喘模型的建立以及肺泡灌洗液獲取29
• 3.7 肺組織切片和HE染色29-30
• 3.8 組織免疫熒光30-31
• 3.9 WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)31
• 3.10 細(xì)胞凋亡檢測(cè)(流式細(xì)胞法)31
• 3.11 PAS染色(過碘酸-Schiff反應(yīng))31
• 3.12 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)31-32
• 3.13 骨髓置換實(shí)驗(yàn)32
• 3.14 蛋白制樣32-33
• 3.15 蛋白質(zhì)印記法(Western blot)33-34
• 3.16 免疫共沉淀(Co-IP)34-35
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-52
• 4.1 Gab2的表達(dá)與氣道黏液分泌相關(guān)性研究35-37
• 4.2 體外實(shí)驗(yàn)顯示Gab2正向調(diào)控黏液基因的表達(dá)37-41
• 4.3 Gab2缺失緩解了OVA誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞化生和黏液分泌41-43
• 4.4 Gab2缺失緩解了OVA誘導(dǎo)的氣道炎癥43-44
• 4.5 骨髓置換實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Gab2正向調(diào)控了體內(nèi)杯狀細(xì)胞的化生黏液的分泌44-46
• 4.6 Gab2正向調(diào)控IL-13介導(dǎo)的TYK2/STAT6信號(hào)通路46-49
• 4.7 Gab2的缺失增強(qiáng)了SOCS3與TYK2的結(jié)合,抑制IL-13誘導(dǎo)的TYK2/STAT6通路49-52
• 5. 討論52-55
• 6. 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 第二章 ：支架蛋白Gab1在髓系來(lái)源樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性哮喘中作用的研究59-101
• 1. 引言59-62
• 2. 材料和試劑62-67
• 2.1 主要儀器62-63
• 2.2 主要試劑耗材63-65
• 2.3 小鼠65-66
• 2.4 細(xì)胞66-67
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法67-76
• 3.1 小鼠哮喘模型的建立以及肺泡灌洗液處理67
• 3.2 肺組織切片和HE染色67-68
• 3.3 免疫組化68
• 3.4 PAS染色68-69
• 3.5 人或者小鼠外周血單核細(xì)胞分離69
• 3.6 BMDM和BMDC的過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)69-70
• 3.7 細(xì)胞RNA提取(Trizol法)及熒光定量PCR70
• 3.8 DC純化70-71
• 3.9 CD4 T細(xì)胞純化71-72
• 3.10 DC抗原吞噬實(shí)驗(yàn)72
• 3.11 DC成熟實(shí)驗(yàn)72
• 3.12 DC抗原遞呈實(shí)驗(yàn)72
• 3.13 體內(nèi)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)72-73
• 3.14 體內(nèi)DC遷移實(shí)驗(yàn)73
• 3.15 體外DC遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell實(shí)驗(yàn))73
• 3.16 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)73-74
• 3.17 蛋白制樣74-75
• 3.18 蛋白質(zhì)印記法(Western blot)75-76
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-93
• 4.1 髓系來(lái)源細(xì)胞缺失Gab1緩解了OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘76-80
• 4.2 過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明Gab1通過影響樹突狀細(xì)胞功能影響過敏性哮喘的發(fā)生6280-85
• 4.3 Gab1缺失對(duì)樹突狀細(xì)胞的抗原吞噬,成熟以及抗原遞呈無(wú)影響85-87
• 4.4 Gab1的缺失阻斷了樹突狀細(xì)胞向淋巴結(jié)的遷移87-89
• 4.5 Gab1正向調(diào)控了樹突狀細(xì)胞的定向遷移89-93
• 5. 討論93-95
• 6. 結(jié)論95-96
• 參考文獻(xiàn)96-101
• 綜述101-112
• 參考文獻(xiàn)107-112
• 作者簡(jiǎn)歷及在讀期間取得的科研成果112-113

【共引文獻(xiàn)】

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