本文關(guān)鍵詞：常氧及低氧狀態(tài)下，，Survivin調(diào)控ROCK-1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的研究

  更多相關(guān)文章： 低氧 RhoA蛋白1 生存素 人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 增殖

【摘要】：目的:1)觀察RhoA蛋白1(Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK-1)在體外培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)中的表達(dá);2)探討促進(jìn)HPASMCs增殖的相關(guān)機(jī)制中,生存素(Survivin)、ROCK-1二者之間的調(diào)控關(guān)系。方法:1.取離體人肺周圍的正常組織,體外培養(yǎng)至第3-8代。將細(xì)胞分組為如下7組:低氧0h(即常氧,37℃,21%O2,5%CO2)組、低氧(37℃、5%CO2、5%O2、90%N2)0.5h組、低氧1h組、低氧2h組、低氧4h組、低氧8h組、低氧12h組,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative realtime-PCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROCK-1 mRNA的表達(dá)水平,然后用western blotting和免疫熒光檢測(cè)ROCK-1蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。2.原代培養(yǎng)HPASMCs,體外構(gòu)建合成出3條ROCK-1小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA),并篩選其中1條抑制HPASMCs中ROCK-1信使RNA(Messenger RNA,mRNA)表達(dá)效率最高(至少70%)的siRNA靶序列,體外構(gòu)建合成出1條Survivin siRNA,同理抑制效率至少70%,利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞,隨后將細(xì)胞分為6組,即常氧空白對(duì)照組、常氧Survivin siRNA組、常氧ROCK-1 siRNA組、低氧空白對(duì)照組、低氧Survivin siRNA組、低氧ROCK-1 siRNA組,用realtime-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROCK-1 mRNA及Survivin mRNA的表達(dá)水平,然后用western blotting檢測(cè)ROCK-1及Survivin蛋白質(zhì)的表達(dá)及變化,CCK8和EDU免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果:1.realtime-PCR方法檢測(cè)mRNA水平。發(fā)現(xiàn),低氧處理后ROCK-1mRNA表達(dá)明顯增加(P0.05),且在低氧4h后表達(dá)至高峰(P0.05);同時(shí)應(yīng)用western blot和免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn),低氧處理后ROCK-1蛋白表達(dá)明顯增加(P0.05),且在低氧4h后達(dá)高峰,而CCK8檢測(cè)在低氧24h、48h、72h后細(xì)胞增殖能力均顯著增高(P0.05)。2.Survivin siRNA能下調(diào)HPASMCs ROCK-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平,而ROCK-1 si RNA不能下調(diào)HPASMCs中Survivin的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)論:1.低氧促進(jìn)HPASMCs增殖。2.低氧可導(dǎo)致HPASMCs中ROCK-1表達(dá)增加,提示ROCK-1信號(hào)可能參與HPASMCs的增殖。3.Survivin siRNA能抑制ROCK-1在HPASMCs中的表達(dá),反之不然,說(shuō)明Survivin在HPASMCs增殖信號(hào)傳導(dǎo)的通路中位于ROCK-1的上游,且Survivin、ROCK-1均促進(jìn)HPASMCs增殖。
【關(guān)鍵詞】：低氧 RhoA蛋白1 生存素 人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 增殖
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 主要英文縮略詞索引4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 前言13-15
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料15-19
• 2.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑15-16
• 2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器16-19
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法19-29
• 3.1 原代培養(yǎng)HPASMCs19-20
• 3.1.1 組織取材19
• 3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)19-20
• 3.2 人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的染色、鑒定20
• 3.3 實(shí)驗(yàn)分組20-21
• 3.4 ROCK-1 si RNA及Survivin siRNA的序列設(shè)計(jì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染21
• 3.5 realtime-PCR21-23
• 3.5.1 細(xì)胞RNA的提取21-22
• 3.5.2 紫外吸收法測(cè)定RNA的濃度及純度22
• 3.5.3 cDNA合成22
• 3.5.4 realtime-PCR方法檢測(cè)HPASMCs中ROCK-1、Survivin的mRNA表達(dá)水平22-23
• 3.6 用Western-blot方法檢測(cè)HPASMCs中ROCK-1、Survivin、β-actin蛋白的表達(dá)量23-26
• 3.6.1 細(xì)胞總蛋白的提取23-24
• 3.6.2 應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度24
• 3.6.3 蛋白電泳24-25
• 3.6.4 轉(zhuǎn)膜25
• 3.6.5 免疫反應(yīng)25-26
• 3.6.6 化學(xué)發(fā)光26
• 3.6.7 膠片圖像分析26
• 3.7 細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK8檢測(cè)）26-27
• 3.8 免疫熒光27-29
• 3.8.1 細(xì)胞免疫熒光27
• 3.8.2 EDU免疫熒光27-29
• 第4章 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29-31
• 第5章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-45
• 5.1 HPASMCs的鑒定31-32
• 5.2 常氧及低氧狀態(tài)下，HPASMCs中ROCK-1 表達(dá)情況32-37
• 5.2.1 realtime-PCR檢測(cè)HPASMCs中ROCK-1 mRNA的表達(dá)32-33
• 5.2.2 Western blot檢測(cè)HPASMCs中ROCK-1 蛋白表達(dá)33-34
• 5.2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力34-35
• 5.2.4 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞ROCK-1 蛋白的表達(dá)35-37
• 5.3 ROCK-1 與Survivin促進(jìn)HPASMCs增值信號(hào)通路中的關(guān)系37-45
• 5.3.1 realtime-PCR檢測(cè)HPASMCs中ROCK-1 與SurvivinmRNA的表達(dá)37-38
• 5.3.2 Western blot檢測(cè)HPASMCs中ROCK-1、Survivin蛋白質(zhì)表達(dá)38-40
• 5.3.3 CCK8檢測(cè)HPASMCs增殖40-41
• 5.3.4 EDU免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞增殖41-45
• 第6章 討論45-49
• 第7章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 文獻(xiàn)綜述55-63
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 附錄63-64
• 致謝64-65

【相似文獻(xiàn)】

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1 ;應(yīng)激適應(yīng)比低氧適應(yīng)在更大程度上增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)亞致命性低氧的抵抗[J];高原醫(yī)學(xué)雜志;1995年01期

2 趙誠(chéng)民;低氧儀及其研制開(kāi)發(fā)的意義[J];體育科學(xué);2000年02期

3 呂國(guó)蔚;低氧反應(yīng)通路[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2001年01期

4 于天正,馬傳桃;低氧對(duì)培養(yǎng)的不同內(nèi)徑的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;2001年01期

5 呂國(guó)蔚;低氧耐受動(dòng)物細(xì)胞的耐低氧策略[J];高原醫(yī)學(xué)雜志;2001年01期

6 錢頻,王關(guān)嵩,蒙偉宗,關(guān)崧,陳維中;低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子基因表達(dá)的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

7 陳寶元;慢性阻塞性肺疾病夜間低氧研究的進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(呼吸系統(tǒng)分冊(cè));2003年01期

8 周兆年;低氧與健康研究[J];中國(guó)基礎(chǔ)科學(xué);2003年05期

9 陳偉,陳家佩,葛世麗,從玉文,付小兵;低氧對(duì)大鼠肝腎組織內(nèi)紅細(xì)胞生成素和低氧誘導(dǎo)因子-1α基因表達(dá)的影響[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2004年01期

10 王映梅,李青,閆慶國(guó),惠延平,馬福成,胡沛臻;低氧對(duì)家兔心臟成纖維細(xì)胞增殖與表型的影響[J];心臟雜志;2004年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 秦嶺;文賽蘭;井然;宋智;李岑;向陽(yáng);;間歇性低氧對(duì)小鼠瘦素及其受體表達(dá)的影響[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2006年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

2 陳學(xué)群;杜繼曾;;低氧腦-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)作用[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第23屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要文集[C];2010年

3 郭世榮;李式軍;李娟;解衛(wèi)華;;根際低氧逆境的危害和蔬菜作物的耐低氧性研究進(jìn)展[A];中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第四屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2000年

4 景孝堂;范文紅;吳燕;楊應(yīng)忠;范明;;神經(jīng)發(fā)育中低氧相關(guān)新基因的篩選[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第六屆應(yīng)用生理學(xué)委員會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

5 杜繼曾;陳學(xué)群;張穎沙;劉健翔;許寧一;張家興;;低氧下生長(zhǎng)發(fā)育抑制與認(rèn)知功能促進(jìn)的調(diào)節(jié)機(jī)制[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第五屆比較生理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

6 單淑香;;慢性阻塞性肺疾病患者睡眠低氧的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2011（第十二次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議）論文匯編[C];2011年

7 馬子敏;范明;;低氧損傷與離子通道[A];2003’離子通道、受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)專題研討會(huì)專輯[C];2003年

8 李海生;陳金武;朱玲玲;趙彤;趙惠卿;馬蘭;丁愛(ài)石;范明;;不同程度持續(xù)低氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第六屆應(yīng)用生理學(xué)委員會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

9 彭兆云;孫學(xué)軍;練慶林;蔣春雷;;高壓氧預(yù)處理提高小鼠耐低氧能力的實(shí)驗(yàn)研究[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第六屆應(yīng)用生理學(xué)委員會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

10 洪欣;尹昭云;謝印芝;呂永達(dá);;低氧時(shí)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能變化及其在肺水腫發(fā)生中的作用[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第六屆全國(guó)青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2003年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 本報(bào)記者 周仲全;窒息的海洋[N];遼寧日?qǐng)?bào);2008年

2 ;低氧健身好處多[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

3 王雪飛;間歇性低氧對(duì)學(xué)習(xí)記憶有利[N];健康報(bào);2004年

4 李慶;健身新概念：低氧運(yùn)動(dòng)[N];工人日?qǐng)?bào);2000年

5 記者 馬芳;地下鼠低氧生存源自基因突變[N];南方日?qǐng)?bào);2014年

6 北京體育大學(xué)科研中心教授 胡揚(yáng);低氧運(yùn)動(dòng)也很棒[N];健康報(bào);2010年

7 健康時(shí)報(bào)記者 葉依;睡幾天“低氧屋”也能減肥？[N];健康時(shí)報(bào);2008年

8 記者 嚴(yán)存義 周丹波;高原低氧關(guān)注健康[N];甘肅日?qǐng)?bào);2003年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉超;涎腺腺樣囊性癌中低氧與自噬相關(guān)基因的生物信息學(xué)研究[D];山東大學(xué);2015年

2 紀(jì)志鵬;低氧預(yù)處理誘導(dǎo)的HIF-1α可促進(jìn)缺血再灌注損傷肝臟糖代謝并保護(hù)線粒體的研究[D];山東大學(xué);2015年

3 李海生;低氧促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化及其機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

4 黃群華;血小板源生長(zhǎng)因子及其受體在低氧性肺血管平滑肌細(xì)胞增殖中的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制探討[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1999年

5 張家興;模擬高原間歇性低氧對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響[D];浙江大學(xué);2005年

6 孫希武;不同程度減壓低氧對(duì)心功能的影響及其機(jī)制探討[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1995年

7 鄭瀾;低氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)肌組織血管生成的機(jī)制[D];上海體育學(xué)院;2004年

8 何艷;淋巴細(xì)胞膜K（v）通道在低氧免疫及適應(yīng)中的作用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2002年

9 馬慧娟;活性氧在慢性間歇性低壓低氧適應(yīng)性心臟保護(hù)形成中的作用和機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

10 戴濤;低氧對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響及機(jī)制探討[D];浙江大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周姍姍;低氧預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)慢性腎衰竭大鼠腎臟的修復(fù)作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 嚴(yán)衛(wèi)亞;低氧預(yù)處理MSCs通過(guò)Pim-1高表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2015年

3 王慧娟;低氧對(duì)團(tuán)頭魴生理生化指標(biāo)及低氧應(yīng)答基因表達(dá)的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 吳鑫杰;低氧對(duì)團(tuán)頭魴細(xì)胞凋亡及抗氧化酶活性的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 寇蓬;Twist在低氧微環(huán)境中宮頸癌順鉑耐藥的作用及機(jī)制研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

6 李錦松;金絲桃苷對(duì)低氧時(shí)大鼠認(rèn)知功能損傷的改善作用及其抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制[D];廣東藥學(xué)院;2015年

7 郭佳;宮內(nèi)生理性低氧微環(huán)境對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎早期腎臟發(fā)育的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

8 張振中;低氧處理對(duì)不同年齡段C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

9 張建明;低氧下cyclinB1表達(dá)與肝癌細(xì)胞對(duì)Hsp90抑制劑17-DMAG耐藥性的關(guān)系探討[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

10 吳國(guó)瑞;低氧微環(huán)境對(duì)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及對(duì)BCL-2表達(dá)的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

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