本文關(guān)鍵詞：調(diào)控局部ACE2和Mas受體對LPS致急性肺損傷的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究

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【摘要】：急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是一種以急性呼吸衰竭及嚴(yán)重低氧血癥為特征的危重疾病。盡管臨床醫(yī)療措施不斷進(jìn)步,但是這一危重疾病的死亡率仍30%,是重癥監(jiān)護(hù)病房內(nèi)威脅患者生命的主要原因之一。急性呼吸窘迫綜合征可由各種肺內(nèi)、肺外致病因素導(dǎo)致,其中膿毒癥是最常見的病因。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),由革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁釋放而出,被認(rèn)為是導(dǎo)致嚴(yán)重膿毒癥的始發(fā)因素。近年來的研究顯示,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)包含兩個(gè)功能互相拮抗的軸系:血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)-血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)-血管緊張素Ⅱ的1型受體(AT-1R)和血管緊張素2(ACE2)-血管緊張素1-7(Ang1-7)-Mas受體。其中,ACE和ACE2協(xié)同調(diào)節(jié)AngⅡ及Ang1-7的水平,可能在ARDS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用;然而,其在局部肺組織的調(diào)節(jié)和具體的信號傳導(dǎo)機(jī)制尚未闡明。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號通路是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分,在急性肺損傷(acute lung injury,ALI)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,我們提出假設(shè):在LPS導(dǎo)致急性肺損傷過程中,局部RAS成分發(fā)生改變,調(diào)控局部ACE/ACE2的表達(dá)可改善肺損傷,而MAPKs信號通路在其中發(fā)揮關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。本研究共分以下三部分內(nèi)容:第一部分血管緊張素抑制劑(ACEI)預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的作用及其機(jī)制目的:觀察ACEI預(yù)處理在LPS導(dǎo)致急性肺損傷時(shí)的作用并探討其作用機(jī)制。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)-經(jīng)尾靜脈注射LPS(7.5mg/Kg)建立大鼠急性肺損傷模型;干預(yù)組大鼠在注射LPS前30分鐘經(jīng)腹腔給予卡托普利(Captopril,50mg/Kg)預(yù)處理,對照組給予等量生理鹽水。體外實(shí)驗(yàn)-大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)卡托普利(10-5mol/ml),或合并應(yīng)用ACE2抑制劑MLN-4760(10-7mol/ml)預(yù)處理30分鐘后給予LPS(1mg/ml)刺激。肺組織切片HE染色評估肺損傷程度,免疫組化染色及western-blot檢測肺組織ACE/ACE2表達(dá),ELISA法檢測血漿及細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、AngⅡ及Ang1-7濃度,western-blot法檢測細(xì)胞中ACE/ACE2表達(dá)及MAPKs信號通路激活。結(jié)果:卡托普利預(yù)處理可明顯減輕LPS導(dǎo)致的肺組織病理改變,抑制炎癥因子TNF-α及IL-6分泌,降低血漿AngⅡ/Ang1-7比例,并逆轉(zhuǎn)肺組織中ACE上調(diào)和ACE2下調(diào)的表達(dá)變化,顯著降低ACE/ACE2比值(LPS組為7.07,LPS+Captopril組為1.71)。卡托普利的保護(hù)作用在體外實(shí)驗(yàn)中亦得到證實(shí)�？ㄍ衅绽A(yù)處理明顯減輕LPS所致細(xì)胞毒性,抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生,也顯著降低ACE/ACE2表達(dá)比值(LPS組為5.18,LPS+Captopril組為1.52)。另外,卡托普利預(yù)處理可明顯抑制LPS刺激所致細(xì)胞p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化水平升高。同時(shí)應(yīng)用MLN-4760預(yù)處理可阻斷卡托普利對LPS所致細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及對LPS導(dǎo)致p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化的抑制作用。結(jié)論:ACEI預(yù)處理可能通過調(diào)節(jié)局部ACE/ACE2表達(dá)平衡及抑制MAPKs信號通路活化,發(fā)揮對LPS所致急性肺損傷及PMVECs細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或sh RNA-Ace2調(diào)控大鼠PMVECs的ACE2表達(dá)對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制目的:通過調(diào)控ACE2在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá),探討其對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用及信號機(jī)制。方法:應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或sh RNA-Ace2,使ACE2在PMVECs過表達(dá)或抑制,結(jié)合應(yīng)用Mas受體阻滯劑A779(100 n M)、MAPKs通路阻滯劑(SB20358010μM,PD98059 20μM,SP600125 20μM)預(yù)處理后,給予LPS(1mg/ml)刺激。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、AngⅡ及Ang1-7濃度,western-blot法檢測細(xì)胞中ACE/ACE2表達(dá)及MAPKs/NF-κB信號通路激活。結(jié)果:LPS刺激導(dǎo)致PMVECs分泌炎癥因子及AngⅡ及Ang1-7明顯增加,細(xì)胞凋亡顯著,并伴有ACE2/ACE比值明顯下降;過表達(dá)ACE2可明顯減少LPS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放,并使ACE2/ACE比值及Ang1-7水平顯著升高;而抑制ACE2表達(dá)則進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng);應(yīng)用A779預(yù)處理可完全消除ACE2對細(xì)胞的這種保護(hù)作用。LPS刺激可使細(xì)胞內(nèi)p38、ERK1/2、JNK及NF-κB信號通路激活,A799預(yù)處理進(jìn)一步提高其磷酸化水平。A779預(yù)處理亦可阻斷過表達(dá)ACE2對p38、JNK磷酸化及NF-κB激活的抑制。然而,僅有JNK阻斷劑可明顯減輕由下調(diào)ACE2或A779預(yù)處理惡化的LPS所致細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。結(jié)論:ACE2/Ang1-7/Mas受體軸在抑制LPS誘導(dǎo)PMVECs凋亡及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制可能是通過阻滯JNK/NF-κB信號通路激活。第三部分慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或sh RNA-Ace2調(diào)控大鼠肺內(nèi)ACE2表達(dá)對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的作用及其機(jī)制目的:通過調(diào)控大鼠肺內(nèi)ACE2表達(dá),觀察其對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的作用及信號機(jī)制。方法:經(jīng)氣管內(nèi)滴注慢病毒顆粒包裹的Ace2或shRNA-Ace2進(jìn)行大鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá),或結(jié)合應(yīng)用MLN-4760(1mg/Kg)或A779(10μg/kg)預(yù)處理,繼之經(jīng)尾靜脈注射LPS(7.5mg/Kg)建立肺損傷模型。肺組織切片HE染色評估肺損傷程度,ELISA法檢測肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、AngⅡ及Ang1-7濃度,western-blot法檢測肺組織中ACE/ACE2表達(dá)及MAPKs信號通路磷酸化水平,RT-PCR法檢測肺組織中Mas m RNA表達(dá)。結(jié)果:ACE2過表達(dá)可以明顯減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷程度及炎癥因子釋放,抑制ACE2表達(dá)則顯著惡化肺損傷及炎癥反應(yīng),而藥物阻斷Mas受體或ACE2均可抑制過表達(dá)ACE2的這一保護(hù)作用。過表達(dá)ACE2可明顯降低肺泡灌洗液中AngⅡ/Ang1-7比例,并上調(diào)Mas m RNA表達(dá),而Mas受體阻斷劑或ACE2抑制劑均可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化。ACE2過表達(dá)可明顯抑制LPS導(dǎo)致p38、ERK1/2、及JNK激活,而抑制ACE2表達(dá)則明顯增強(qiáng)ERK1/2、JNK磷酸化水平。Mas受體阻斷劑或ACE2抑制劑均可明顯消除ACE2過表達(dá)對p38、ERK1/2磷酸化的抑制。結(jié)論:ACE2主要通過Ang1-7/Mas途徑及抑制p38、EKR1/2信號通路激活發(fā)揮對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的保護(hù)作用。總結(jié)在內(nèi)毒素導(dǎo)致急性肺損傷過程中,肺組織內(nèi)ACE2及ACE表達(dá)失衡及其導(dǎo)致的AngⅡ/Ang1-7比值變化具有重要作用;上調(diào)ACE2表達(dá)可在肺損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用,其作用機(jī)制主要是通過Ang1-7/Mas受體途徑,并抑制MAPKs/NF-κB信號通路激活。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 血管緊張素 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 Mas受體 MAPKs信號通路
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563.8
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 英文縮略詞匯表14-15
• 第一部分 血管緊張素抑制劑（ACEI）預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的作用及其機(jī)制15-40
• 1. 前言15-16
• 2. 材料與方法16-25
• 3. 結(jié)果25-36
• 4. 討論36-39
• 5. 結(jié)論39-40
• 第二部分 慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或shRNA-Ace2調(diào)控大鼠PMVECs的ACE2表達(dá)對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制40-93
• 1. 前言40-41
• 2. 材料與方法41-74
• 3. 結(jié)果74-88
• 4. 討論88-92
• 5. 結(jié)論92-93
• 第三部分 慢病毒轉(zhuǎn)染Ace2或shRNA-Ace2調(diào)控大鼠肺內(nèi)ACE2表達(dá)對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的作用及其機(jī)制93-112
• 1. 前言93-94
• 2. 材料與方法94-99
• 3. 結(jié)果99-108
• 4. 討論108-111
• 5. 結(jié)論111-112
• 參考文獻(xiàn)112-119
• 致謝119-120
• 攻讀博士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果120

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本文編號：882549