本文關(guān)鍵詞：重組大鼠CC16蛋白質(zhì)對LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細胞炎癥因子表達的抑制作用及機制研究

  更多相關(guān)文章： 重組CC16蛋白質(zhì) 脂多糖 核因子-κB 炎癥因子 網(wǎng)格蛋白

【摘要】：CC16蛋白質(zhì)主要由位于終末細支氣管的無纖毛柱狀上皮細胞(Clara cell)分泌產(chǎn)生,其分子量接近16k D,所以稱之為CC16。目前認為CC16是肺的內(nèi)源性抗炎因子,具有重要的免疫炎癥調(diào)節(jié)作用。慢性炎癥性肺部疾病例如COPD,患者肺內(nèi)Clara細胞及CC16明顯降低,促進了疾病的發(fā)生發(fā)展。參與COPD發(fā)病的重要炎癥介質(zhì)包括MMP-9,IL-6,IL-8,TNF-α,而NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中具有重要地位。外源性給予抗炎因子CC16,有可能抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,從而對炎癥性肺部疾病產(chǎn)生治療干預(yù)作用。本研究首先利用基因工程技術(shù),誘導(dǎo)表達重組的CC16蛋白質(zhì),純化并鑒定具有生物學(xué)活性后,用于炎癥干預(yù)研究。通過LPS刺激誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠氣道上皮細胞,產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì),給予重組的CC16蛋白質(zhì)進行干預(yù)后,觀察各炎癥因子的變化。進一步應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),探討重組CC16抑制炎癥因子產(chǎn)生的分子機制。為重組CC16作為抗炎劑用于炎癥性肺疾病,如COPD等疾病的治療提供理論依據(jù)。第一部分大鼠Clara細胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表達及純化目的:克隆大鼠Clara細胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表達并純化重組的CC16蛋白,為進一步研究CC16蛋白的功能及對炎癥性肺部疾病的治療作用奠定基礎(chǔ)。方法:制備大鼠肺組織總RNA,根據(jù)大鼠CC16基因全長編碼序列(Gen Bank登錄號:NM_013051)的開放閱讀框設(shè)計引物并進行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入p ET30a(+)原核表達載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(E.coli DH5α),陽性克隆經(jīng)菌液PCR、雙酶切及測序進行鑒定。將重組質(zhì)粒p ET30a(+)-r CC16轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta(DE3)并加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合考馬斯亮藍染色檢測表達產(chǎn)物,重組融合蛋白經(jīng)Ni2+瓊脂糖凝膠親和純化。分別以抗His標簽抗體和山羊抗CC16抗體進行免疫印跡(Western blotting)分析并鑒定重組蛋白。采用高效液相色譜法測定重組蛋白的純度。結(jié)果:RT-PCR擴增產(chǎn)物約為290 bp。菌落PCR、雙酶切及測序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒p ET30a(+)-r CC16構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果顯示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得相對分子質(zhì)量約16 k D的可溶性重組蛋白。免疫印跡(Western blotting)結(jié)果表明,誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)為帶His標簽的重組融合蛋白,而且能被山羊抗CC16抗體識別。經(jīng)測定重組CC16蛋白質(zhì)純度為96.03%結(jié)論:成功構(gòu)建基因重組體p ET30a(+)-r CC16,并制備出可溶性大鼠重組CC16蛋白質(zhì)。第二部分重組CC16蛋白質(zhì)通過NF-κB信號通路抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的氣道上皮炎癥介質(zhì)的表達第一節(jié)重組CC16蛋白質(zhì)對LPS誘導(dǎo)的IL-8、IL-6、TNF-:和MMP-9表達的影響目的:明確重組大鼠CC16(r CC16)對LPS誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的干預(yù)作用。方法:(1)采用酸堿滴定法,通過測定磷脂酶A2(PLA2)的活性,驗證重組的CC16蛋白質(zhì)是否具有生物學(xué)活性。(2)體外培養(yǎng)大鼠氣道上皮(RTE)細胞,以不同劑量r CC16(5、10和20μg/ml)與RTE共孵育1、3、5、7天,采用CCK-8試劑盒和臺盼藍染色法測定r CC16對RTE細胞增殖及活力的影響。(3)體外培養(yǎng)RTE細胞,加入LPS(0.1μg/ml)刺激細胞,并以不同劑量r CC16(0.5、1.0和2.0μg/ml)進行干預(yù)24h。采用ELISA法測定細胞上清中MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-α的含量;采用反轉(zhuǎn)錄q PCR法測定各組細胞MMP-9、IL-6和TNF-αm RNA水平;采用明膠酶譜法測定MMP-9的活性。結(jié)果:(1)體外實驗顯示r CC16可抑制PLA2的活性,并呈劑量依賴性,在劑量為0.5μg/ml時即有抑制作用,隨著劑量的增大(1.0和2.0μg/ml),r CC16對PLA2的抑制作用更加明顯。(2)r CC16在較大劑量時(10μg/ml和20μg/ml)對RTE細胞的增殖有抑制作用,但對RTE的細胞活性無影響。根據(jù)以上兩部分實驗結(jié)果,我們選擇低劑量r CC16(小于5μg/ml)作為干預(yù)研究的劑量,該劑量下r CC16對細胞增殖及活性無影響,同時又具備了生物活性。(3)LPS刺激RTE細胞24h后,MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αm RNA及蛋白含量較對照組明顯升高,MMP-9活性亦增高。給予不同劑量r CC16干預(yù)后,LPS誘導(dǎo)的上述炎癥介質(zhì)的表達被抑制。r CC16對MMP-9、IL-6和IL-8的抑制作用呈劑量依賴性,隨著r CC16劑量增加抑制作用增強,而對TNF-α的抑制則表現(xiàn)為低劑量r CC16(0.5μg/ml)強于較高劑量組。結(jié)論:r CC16蛋白質(zhì)具有抗炎活性,在不影響RTE細胞增殖及活性的劑量下,可抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αm RNA及蛋白的表達。第二節(jié)重組CC16蛋白質(zhì)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化及其機制研究目的:探討r CC16抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達的分子機制。方法:體外培養(yǎng)RTE細胞,加入LPS刺激細胞,并以不同劑量r CC16進行干預(yù)1h。以雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測各組NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。提取胞核蛋白,采用電泳遷移率(EMSA)實驗檢測NF-κB與靶基因的結(jié)合能力。分別提取胞漿、胞核蛋白,采用Western blotting法檢測NF-κBp65的核漿含量,同時用免疫熒光染色顯示NF--κBp65的胞內(nèi)分布。應(yīng)用Western blotting檢測LPS刺激及r CC16干預(yù)后RTE細胞I-κBα、p-I-κBα、p-NF-κB、total NF-κB、p38和p-p38的變化。結(jié)果:(1)LPS刺激后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯增高,較空白對照組高出約9倍。1μg/ml和2μg/ml的r CC16均可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,并呈劑量依賴性,抑制率分別為38.8%和62.6%。(2)LPS可促進RTE細胞NF-κB與DNA的結(jié)合,而1μg/ml和2μg/ml的r CC16可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB與DNA的結(jié)合。(3)LPS刺激RTE細胞后,細胞核內(nèi)NF-κB含量明顯增多,給予不同劑量r CC16干預(yù)后,細胞核內(nèi)NF-κB含量較單純LPS組明顯降低,并具有劑量依賴性,隨著r CC16劑量增加,細胞核內(nèi)NF-κB含量更少。(4)LPS刺激RTE細胞后磷酸化的IκBα、NF-κBp65和p38明顯增多。不同劑量r CC16干預(yù)后,它們的磷酸化水平較單純LPS刺激組下降,并呈劑量依賴性,隨r CC16劑量增加對IκBα、NF-κBp65和p38磷酸化的抑制作用增加。結(jié)論:r CC16可通過兩條途徑抑制LPS誘導(dǎo)的RTE細胞抑制NF-κB的活化:①抑制I-κB的磷酸化,從而抑制NF-κB的核定位;②抑制p38的磷酸化,進而抑制NF-κBp65的磷酸化。第三部分重組CC16蛋白質(zhì)通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞入胞機制的初步探討目的:初步探討網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(CME)在r CC16進入RTE細胞及其發(fā)揮抗炎效應(yīng)中的作用。方法:(1)體外培養(yǎng)RTE細胞,分為空白對照組、r CC16組和Chlorpromazine(CME抑制劑)+r CC16組。Chlorpromazine+r CC16組在加入Chlorpromazine(30μM)30 min后在加入r CC16(2μg/ml),r CC16組直接在培養(yǎng)基中加入r CC16(2μg/ml)。采用免疫熒光染色法,一抗采用抗His標簽抗體,觀察各組細胞r CC16的分布情況。(2)體外培養(yǎng)RTE細胞,在培養(yǎng)體系中加入Chlorpromazine抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用后,以r CC16干預(yù)LPS刺激的細胞,采用Western blotting和免疫熒光染色法檢測各組RTE細胞NF-κB的核定位情況,采用Elisa法檢測細胞上清中MMP-9的含量。結(jié)果:(1)r CC16進入RTE細胞,主要分布于胞漿中,若于r CC16加入前,先給予網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞的抑制劑Chlorpromazine,則顯示RTE細胞中紅色熒光分布明顯減少,提示進入細胞內(nèi)的r CC16減少。(2)在加入r CC16前給予Chlropromazine,則r CC16對LPS誘導(dǎo)的NF-κB核定位的抑制作用減弱,即核內(nèi)NF-κB含量仍較多,相應(yīng)地,胞漿中NF-κB含量較r CC16干預(yù)組減少。(3)如果在加入r CC16前,給予網(wǎng)格蛋白抑制劑Chlropromazine,則發(fā)現(xiàn)r CC16對LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達的抑制作用減弱,即上清液中MMP-9含量仍較多。結(jié)論:抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞后,r CC16對LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化和MMP-9表達的抑制作用明顯減弱,初步證明網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與了r CC16發(fā)揮抗炎作用的過程。
【關(guān)鍵詞】：重組CC16蛋白質(zhì) 脂多糖 核因子-κB 炎癥因子 網(wǎng)格蛋白
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R56
【目錄】：

• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 常用縮寫詞中英文對照表18-20
• 前言20-23
• 第一部分 大鼠Clara細胞分泌蛋白CC16 基因的克隆和原核表達及純化23-44
• 1 材料與方法23-37
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-37
• 2 結(jié)果37-42
• 2.1 rCC16 基因的擴增37
• 2.2 pET-30a（+）-rCC16 重組載體的構(gòu)建與鑒定37-38
• 2.3 重組蛋白CC16 的誘導(dǎo)表達38-39
• 2.4 重組蛋白His-rCC16 的Western blotting鑒定39
• 2.5 重組CC16 蛋白質(zhì)純化后純度粗測39-40
• 2.6 重組CC16 蛋白內(nèi)毒素含量40
• 2.7 重組CC16 蛋白純度檢測40-42
• 3 討論42-44
• 第二部分 重組CC16 蛋白質(zhì)通過NF-κB信號通路抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的氣道上皮炎癥介質(zhì)的表達44-81
• 第一節(jié) 重組CC16 蛋白質(zhì)對LPS誘導(dǎo)的IL-8、IL-6、TNF-α和MMP-9 表達的影響44-61
• 1 材料和方法44-53
• 1.1 材料44-45
• 1.2 方法45-53
• 2 結(jié)果53-61
• 2.1 重組大鼠CC16 蛋白質(zhì)生物活性53
• 2.2 重組大鼠CC16 對RTE細胞的毒性作用研究53-55
• 2.3 不同劑量r CC16 對LPS誘導(dǎo)的RTE細胞MMP-9、IL-6、IL-8 和TNF-α蛋白水平的影響55-57
• 2.4 不同劑量rCC16 對LPS誘導(dǎo)RTE細胞MMP-9、IL-6 和TNF-α mRNA的影響57-59
• 2.5 不同劑量rCC16 對LPS誘導(dǎo)RTE細胞MMP-9 活性的影響59-61
• 第二節(jié) 重組CC16 蛋白質(zhì)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化及其機制研究61-81
• 1 材料和方法61-72
• 1.1 材料61-62
• 1.2 方法62-72
• 2 結(jié)果72-77
• 2.1 rCC16 對LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及DNA結(jié)合能力的影響72
• 2.2 rCC16 對LPS誘導(dǎo)的NF-κB核定位的影響72-74
• 2.3 rCC16 對LPS誘導(dǎo)的IκBα磷酸化的抑制作用74-75
• 2.4 rCC16 對LPS誘導(dǎo)的NF-κBp65 和p38 磷酸化的抑制作用75-77
• 3 討論77-81
• 第三部分 重組CC16 蛋白質(zhì)通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞入胞機制的初步探討81-94
• 1 材料和方法81-86
• 1.1 材料81-82
• 1.2 方法82-86
• 2 結(jié)果86-91
• 2.1 rCC16 在RTE細胞的分布86-87
• 2.2 Chlropromazine對rCC16 干預(yù)LPS誘導(dǎo)的NF-κB核定位的影響87-89
• 2.3 Chlropromazine對rCC16 干預(yù)LPS誘導(dǎo)的MMP-9 表達的影響89-91
• 3 討論91-94
• 全文主要結(jié)論94-95
• 參考文獻95-102
• 綜述102-114
• 參考文獻109-114
• 致謝114-115
• 在學(xué)期間承擔/參與的科研課題與研究成果115-116
• 個人簡歷116

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：854268