本文關(guān)鍵詞：油酸致A549細胞損傷模型建立及其對SP-B影響研究

  更多相關(guān)文章： 急性肺損傷 OA干預(yù) LPS干預(yù) 肺表面活性物質(zhì)B 定量研究

【摘要】：主要目的:大量研究顯示油酸(oleic acid,OA)所致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)動物模型的病理學(xué)變化與與臨床極為相似,但其致傷機制尚不太明確,且國內(nèi)外關(guān)于OA致傷的體外模型層面研究較少。我們嘗試建立OA刺激致肺泡II型上皮細胞株A549細胞損傷的體外模型,并探討不同濃度OA損傷對A549細胞SP-B的影響。主要實驗內(nèi)容和方法:1.實驗分組:A549細胞培養(yǎng)至3代后,融合率80%。(1)對照組:不加入OA,替代以實驗組等量的DMEM(不含胎牛血清),37℃孵箱培養(yǎng)24h;(2)AO組:按照AO終濃度分別分為300umol/L、400 umol/L、500 umol/L及600 umol/L 4個亞組,37℃孵箱培養(yǎng)24h;LPS組:(1)對照組:同OA對照組;(2)實驗組:按照0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/ml的LPS濃度分為4個實驗組,37℃孵箱培養(yǎng)24h;2.光鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化,CCK-8法檢測細胞增殖活性:細胞長勢符合實驗要求后,按實驗分組濃度刺激。先用倒置顯微鏡,200倍鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。加入CCK-8,采用GEN5軟件及酶標儀,進行OD值檢測。3.ELISA檢測SP-B表達:各組細胞按4×104個/ml接種于96孔孔板中,5個復(fù)孔每組,共需接5組。每孔上清液于24h后收集,按ELISA試劑盒操作說明書對收集的上清液進行SP-B表達檢測分析。4.Western Blot檢測SP-B分泌:細胞傳至3代以后,對上清液及細胞進行程序化處理,按照Western Blot檢測試劑盒操作說明書對收集的SP-B分泌及表達水平進行檢測。5.統(tǒng)計學(xué)分析:統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS16.0,有效數(shù)字保留小數(shù)點后2位,計量資料采用sx?形式表達,計量資料采用單因素方差分析。當(dāng)P值小于0.05時,我們認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。主要研究結(jié)果:1.細胞形態(tài)學(xué)變化:OA對照組A549細胞胞質(zhì)豐富、呈多角形,細胞突起明顯,貼壁性生長,融合成片,無核固縮;300umol/L組,細胞胞體輕微變圓,體積略微縮小,突起逐漸減少,少量大小不均的顆粒開始出現(xiàn)于胞質(zhì)內(nèi);400 umol/L組,細胞胞體比較明顯的變圓,體積變小,有較多的突起變少,比較多大小不均的顆粒開始出現(xiàn)于胞質(zhì)內(nèi);500 umol/L及600 umol/L組,細胞器開始崩解,碎裂,基本無完整的細胞胞體,皺縮的細胞核開始大量出現(xiàn)。LPS各組隨LPS濃度增加與OA組形態(tài)學(xué)變化一致。2.CCK-8檢測細胞增殖活性:CCK-8檢測檢測顯示300、400、500和600μmol/LOA組OD值呈劑量依賴性下降,分別為空白對照組的87.0%、75.7%、64.4%和56.8%(P0.05)。CCK-8檢測檢測顯示0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/ml LPS組OD值呈劑量依賴性下降,分別為空白對照組的86.7%、75.4%、48.9%和44.0%(P0.05)。3.ELISA檢測上清液中SP-B表達:ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)SP-B表達量隨300、400、500和600μmol/LOA組呈劑量依賴性上升,分別為空白對照組的145.5%、187.4%、223.9%和235.3%(P0.05),,且符合S曲線分布(R=1.00)。除600μmol/LOA組外,各組組間兩兩t檢驗比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)SP-B表達量隨0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/ml LPS組呈劑量依賴性上升,分別為空白對照組的102.7%、124.2%、152.5%和157.2%(P0.05)。部分組間兩兩t檢驗比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.Western Blot檢測SP-B分泌Western Blot檢測表明43KD SP-B表達量隨OA和LPS濃度升高逐步降低,43KD為完整Pro SP-B片段。結(jié)論:在模擬ALI實驗中,隨著細胞逐步破壞,SP-B在膜中的構(gòu)象受到較大影響,胞內(nèi)的SP-B逐步釋放到胞外。OA對A549細胞損傷呈劑量依賴性上升,濃度越高,SP-B釋放胞外越多,SP-B分泌越少,可以為ALI的體外模型研究提供一定的參考價值。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 OA干預(yù) LPS干預(yù) 肺表面活性物質(zhì)B 定量研究
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-8
• 中文摘要8-10
• 1. 前言10-12
• 2. 材料與方法12-22
• 3. 實驗結(jié)果22-28
• 4. 討論28-31
• 全文結(jié)論31-32
• 參考文獻32-36
• 文獻綜述 急性肺損傷不同方式致傷動物模型的研究進展36-45
• 參考文獻41-45
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果45-46
• 致謝46

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