本文關(guān)鍵詞：25D3和1,25D3介導(dǎo)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在人支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 維生素D 維生素D上調(diào)蛋白1 胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素 16-HBE細(xì)胞

【摘要】：前言 支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病,它和氣道的炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞以及細(xì)胞因子等有關(guān)。1990年,我國(guó)兒科哮喘協(xié)作組對(duì)27個(gè)省市0-14歲兒童進(jìn)行調(diào)查,顯示我國(guó)兒童哮喘的患病率為0.09%-2.60%,平均0.91%。2000年再次調(diào)查結(jié)果為0.12%～3.34%,平均1.54%,較10年前平均上升了64.84%。哮喘使很多患者日常生活受到不同程度的影響,據(jù)WHO估計(jì),全球由于哮喘導(dǎo)致的調(diào)整傷殘生命年數(shù)量估計(jì)達(dá)到1500萬(wàn),約占全球總醫(yī)療負(fù)擔(dān)的1%。由哮喘所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)無(wú)論從住院和藥品使用等直接醫(yī)療費(fèi)用還是誤工及非正常死亡等造成的間接非醫(yī)療費(fèi)用都相當(dāng)大。盡管多種新的治療措施和方法已經(jīng)在臨床證實(shí)了確切的療效,但是還有很多的問(wèn)題需要解決。一方面很多的治療并沒(méi)有觸及哮喘的根本,不能起到逆轉(zhuǎn)治療的效果。另一方面一些治療手段還有不同的副作用,有的還需要不斷地進(jìn)行藥物監(jiān)測(cè),給患者造成了極大的不便。因此,不斷探索研究出更新的更有效的治療手段是當(dāng)前迫切的方向,其中從支氣管哮喘病因這個(gè)源頭去發(fā)現(xiàn)和探討疾病的治療方法或許是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。 新的證據(jù)顯示,維生素D不足可以引起包括哮喘在內(nèi)的多種肺部疾病,這有可能是與肺功能受損而導(dǎo)致了感染和炎癥的發(fā)生率增加有關(guān)。這種現(xiàn)象的內(nèi)部機(jī)制尚不清楚,但是維生素D會(huì)影響炎癥和結(jié)構(gòu)細(xì)胞的功能,包括淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞。羥化酶負(fù)責(zé)終止和限制25羥基維生素D3(25-hydroxyvitamin D3,25D3)以循環(huán)和儲(chǔ)存的形式活化合成1,25二羥基維生素D3(l,25-hydroxyvitamin D3,1,25D3)。2008年,Hansdottir等報(bào)道了呼吸道上皮細(xì)胞表達(dá)1α-羥化酶,后者可以將維生素D活化,而維生素D本身會(huì)影響其驅(qū)使基因的表達(dá)水平,并在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的防御作用。1a-羥化酶在呼吸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)表明維生素D在呼吸系統(tǒng)疾病中起著很普遍的影響。 呼吸道上皮細(xì)胞不僅是物理屏障,也可以分泌細(xì)胞因子,例如發(fā)揮免疫應(yīng)答作用的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)。TSLP是一種白介素-7(interleukin-7,IL-7)類(lèi)似的新型細(xì)胞因子,TSLP作為肺內(nèi)的一種多效性的細(xì)胞因子,在變應(yīng)性炎癥和哮喘中起著重要的作用。最近的研究已經(jīng)著眼于TSLP產(chǎn)生機(jī)制,這有助于我們闡明TSLP如何支氣管哮喘發(fā)生和發(fā)展中起作用的�，F(xiàn)已證實(shí),哮喘中存在TSLP基因在呼吸道上皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá),TSLP在過(guò)敏反應(yīng)免疫應(yīng)答的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。在SCC25(human oral squamous carcinoma cell, SCC25,人上皮腫瘤細(xì)胞,由鱗狀細(xì)胞癌衍生而來(lái))中,TSLP的表達(dá)是由1,25D3誘導(dǎo)的。另有證據(jù)顯示,局部應(yīng)用1,25D3可以誘導(dǎo)小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中TSLP的表達(dá)使其增加。然而,維生素D是否會(huì)影響TSLP在人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial, HBE)這一特定的細(xì)胞中表達(dá)尚不清楚。 維生素D3上調(diào)蛋白(vitamin D3upregulated protein1,VDUP1)是硫氧還原蛋白的內(nèi)源性抑制劑,它和維生素D發(fā)揮作用密切相關(guān)。VDUP1最初被認(rèn)為是經(jīng)由1,25D。處理過(guò)的白血病細(xì)胞(human promyelocytic leukemia cells, HL-60cells)的差異表達(dá)基因。該蛋白定位于胞質(zhì),在多種細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮著多種作用。最近的研究證實(shí),VDUP1可以介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白細(xì)胞介素1β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。然而,VDUP1在支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其在這個(gè)細(xì)胞中的活化參與也鮮有人知。 本研究旨在利用16-HBE細(xì)胞證實(shí)維生素D是否增強(qiáng)了TSLP在該細(xì)胞中的表達(dá),以及在此過(guò)程中是否有VDUP1的參與,為探明支氣管哮喘發(fā)生機(jī)制和治療提供參考。 材料和方法 細(xì)胞培養(yǎng)和處理、轉(zhuǎn)染 16-HBE支氣管上皮細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),輔以10%胎牛血清,5%C02,37℃恒溫潮濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至少兩天(70%-80%融合),在刺激前分別用與不用25D3和1,25D3預(yù)處理6h后,給予1000nM伊曲康唑刺激2h。 VDUP1靶向小干擾RNA (SiRNA)序列如下SiRNA1:上游5'-GUCAGAGGCAAUCAUAUUATT-3',下游5'-UAAUAUGAUUGCCUCUGACT G-3'; SiRNA2:上游5'-CUGUGAAGGUGA UGAUAUUTT-31,下游5'-AAU CUCAUCACCUUCACAGTT-3';SiRNA3:上游5'-GAAACAAAUAUGAGUACAATT-3’,下游5'-UUGUACUCAUAUUUGUUU CCA-3'; Negative control (NO:上游5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',下游5'-ACGUGACACGUUCGGAGA ATT-3'=16-HBE細(xì)胞置于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)兩天,調(diào)整細(xì)胞濃度至每孔1.2×105個(gè)。待細(xì)胞融合40%-60%時(shí),用5nM VDUP1特異性SiRNA和HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照SiRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞另培養(yǎng)48h,用500nM的25D3和50nM的1,25D3分別刺激6h。 使用1,25D3的酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒進(jìn)行1,25D3定量 RNA的分離提純和RT-PCR以RT-PCR技術(shù)分析基因的表達(dá)和Mx3005p實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)系統(tǒng)進(jìn)行分析。提取總RNA后,用RNA iso PLUS試劑盒。用Prime ScriptTM的RT試劑盒將RNA合成為500ng cDNA。該定量RT-PCR反映混合物中含有1*SYBR與ExTaq預(yù)混物、200nM正向和反向引物,并在25μL終體積中加入2μL的cDNA。使用的引物分別為：人TSLP(上游：5'-GCCCAGGCTATTCGGA AAC-3',下游：5'-GAAGCGACG CCACAATCC-3'), VDUP1(上游：5'-ACTCGTGTCAAAGCCGTTAGGA-3',下游5'-AGCTCAAAGCCGAACT TGTACTCA-31),β-actin(上游：5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3',下游：5'-GAAAGGGTGTAACGC AACT-3')。通過(guò)CT(循環(huán)閾值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值時(shí),所經(jīng)歷的反應(yīng)循環(huán)數(shù))值來(lái)計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參來(lái)進(jìn)行RNA定量。 Western Blot分析細(xì)胞用PBS洗滌三次,在O℃裂解液中裂解。用Bradford蛋白測(cè)定法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。以10%SDS聚丙酰胺凝膠(每泳道40mg蛋白)電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。以5%脫脂奶的TBST液室溫封閉1h,兔抗人VDUP1多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜(3×15min),1:5000辣根過(guò)氧化物酶孵育,室溫抗兔IgG二抗孵育1h。Super ECL系統(tǒng)經(jīng)由X線檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)。 TSLP的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)上清液中通過(guò)ELISA法檢測(cè)(Bradford總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化定量)測(cè)定TSLP。最低檢測(cè)檢測(cè)水平為31.25pg/mL 統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。組間差異用單因素方差分析法；以Bonferroni法進(jìn)行多重比較。用單側(cè)或雙側(cè)t檢驗(yàn)單獨(dú)比較兩組間差異。P0.05示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 1、25D3誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞TSLP的表達(dá) 不同濃度的25D3(50-1000nM)處理后,16-HBE細(xì)胞的細(xì)胞活力沒(méi)有受到任何影響。根據(jù)劑量-效應(yīng)曲線,TSLP的mRNA水平在25D3的100nM濃度時(shí)顯著增加。并且隨著25D3的濃度增力P,TSLP的nRNA水平不斷增加,在500nM處達(dá)到峰值。因此,500nM濃度被選做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。時(shí)間-反應(yīng)結(jié)果表明(刺激條件：500nM25D3,持續(xù)2-24h)TSLP的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)的水平顯著上調(diào)。 2、25D3誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞VDUP1的表達(dá) 25D3刺激0.5-24h后,細(xì)胞內(nèi)VDUP1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,500nM25D3刺激2-24h后,細(xì)胞內(nèi)VDUP1的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上調(diào)。 3、下調(diào)VDUP1的蛋白表達(dá) 針對(duì)VDUP1合成了三種siRNA (siRNA1和siRNA2, siRNA3)(詳見(jiàn)材料與方法)。從轉(zhuǎn)染的siRNA2或siRNA3的細(xì)胞裂解液中發(fā)現(xiàn)VDUP1水平降低。這種現(xiàn)象在siRNA3中更加明顯,與對(duì)照組相比,VDUP1的表達(dá)減少了35%,VDUP1siRNA3被選做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 4、VDUP1的沉默降低了在16-HBE細(xì)胞中25D3介導(dǎo)的TSLP的合成 采用VDUP1siRNA來(lái)抑制16-HBE細(xì)胞中VDUP1的表達(dá)。用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞存活率大于90%。在同樣濃度D3(500nM)刺激下,經(jīng)siRNA處理后的VDUP1沉默的細(xì)胞,其TSLP的mRNA和蛋白表達(dá)水平都有顯著降低。 5、la-羥化酶抑制后限制了16-HBE細(xì)胞中25D3活化為1,25D3,并且減弱了TSLP的表達(dá) 25D3存在時(shí),16-HBE細(xì)胞可以不經(jīng)任何刺激的情況下,將25D3活化為1,25D3。經(jīng)1000nM伊曲康唑預(yù)處理的16-HBE細(xì)胞,25D3活化為1,25D3的能力顯著降低。在1000nM伊曲康唑預(yù)處理后,由25D3介導(dǎo)的TSLP的mRNA和蛋白水平顯著降低。 6、VDUP1的沉默降低了16-HBE細(xì)胞中1,25D3介導(dǎo)的TSLP的表達(dá)水平 不同濃度的1,25D3(0.1-100nM)中,16-HBE細(xì)胞活力沒(méi)有變化。根據(jù)劑量-效應(yīng)曲線,1,25D3在0.1nM處,TSLP的nRNA和蛋白水平顯著增加,并在50nM處達(dá)到峰值。而當(dāng)同樣在50nM濃度的1,25D3時(shí),TSLP的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在2h時(shí)顯著增加,并在12h處達(dá)到峰值。50nM濃度的1,25D3刺激6h后,測(cè)得、/DUP1的mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明,在16-HBE細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,在50nM終濃度的1,25D3刺激6h后,VDUP1的mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。與對(duì)照組siRNA處理過(guò)的細(xì)胞相比,經(jīng)由50nM濃度的1,25D3處理后的細(xì)胞,當(dāng)VDUP1基因沉默表達(dá)時(shí),其TSLP的mRNA和蛋白水平顯著降低。以上結(jié)果顯示,在16-HBE細(xì)胞中,1,25D3是經(jīng)由VDUP1通路介導(dǎo)TSLP的表達(dá)。 7、1a-羥化酶的抑制對(duì)在16-HBE細(xì)胞中1,25D3誘導(dǎo)的TSLP表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響 1000nM的伊曲康唑預(yù)處理16-HBE細(xì)胞,仍然會(huì)有1,25D3介導(dǎo)生成TSLP。這進(jìn)一步支持了16-HBE細(xì)胞在維生素D活化并介導(dǎo)TSLP表達(dá)通路中,1α-羥化酶并未發(fā)揮作用。 結(jié)論 1、非活化的25D3和活化的1,25D3都可以介導(dǎo)16-HBE細(xì)胞中TSLP的表達(dá)； 2、1α-羥化酶經(jīng)伊曲康唑抑制后,部分抑制了25D3(而不是1,25D3)的TSLP在16-HBE細(xì)胞中的表達(dá)； 3、與25D3相比,極低濃度的1,25D3更能顯著增加TSLP在氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)； 4、維生素D對(duì)TSLP基因表達(dá)的影響是間接的。
【關(guān)鍵詞】：維生素D 維生素D上調(diào)蛋白1 胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素 16-HBE細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25
【目錄】：

• 中文摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 研究背景18-40
• 1. 研究背景18-28
• 2. 材料和方法28-40
• 結(jié)果40-54
• 1. 25D_3的濃度與16-HBE細(xì)胞活力的關(guān)系40-41
• 2. 25D_3誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)表達(dá)增加41-42
• 3. 25D_3誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞VDUP1的表達(dá)增加42-43
• 4. RNA干擾使VDUP1沉默表達(dá)43-44
• 5. VDUP1沉默降低25D_3介導(dǎo)TSLP的合成44-46
• 6. 1α-羥化酶抑制后限制了25D_3活化為1,25D_3,并且減弱了TSLP的表達(dá)46-48
• 7. VDUP1的沉默降低了1,25D_3介導(dǎo)的TSLP的表達(dá)水平48-51
• 8. 1α-羥化酶抑制對(duì)1,25D_3誘導(dǎo)的TSLP表達(dá)水平無(wú)明顯影響51-54
• 討論54-61
• 參考文獻(xiàn)61-78
• 全文小結(jié)78-79
• 綜述79-106
• 參考文獻(xiàn)90-106
• 縮略語(yǔ)中英文對(duì)照106-108
• 在校期間研究成果108-109
• 致謝109-111
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明111

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

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本文編號(hào)：793047