發(fā)布時(shí)間：2017-08-22 09:01

  本文關(guān)鍵詞：殼聚糖及殼聚糖—酵母多糖復(fù)合微球抗大鼠PCP的研究

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【摘要】：背景和目的 肺孢子菌（pneumocystis）可寄生于有免疫缺陷的人和多種哺乳動(dòng)物肺組織內(nèi)，引起肺孢子菌性肺炎（pneumocystis pneumonia，PCP）。在人類PCP經(jīng)常發(fā)生于AIDS、長期接受抗腫瘤藥物和免疫抑制劑的患者。隨著此類患者的增多，PCP患病率呈增多趨勢，因此受到越來越多的關(guān)注。 目前PCP主要依靠藥物治療，常用的藥物有磺胺甲基異惡唑-甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim-Sulfamethoxazole，Tmp-Smz）、潘他米丁、氨苯砜和阿托伐醌等。但是這些藥物的治療效果欠佳，并且存在不同程度的副作用，并隨之出現(xiàn)了對(duì)這些藥物的耐受性。因此研究新的抗PCP的藥物變的日益迫切。 殼聚糖為一種多聚糖，通常是有甲殼素通過脫乙酰作用獲得，殼聚糖制取方便并且具有好的生物學(xué)相容性、生物可降解性和無毒性。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖具有抗細(xì)菌和真菌的作用。酵母多糖為來自于釀酒酵母，可以作為Dectin-1受體的激活劑，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)Dectin-1受體具有抵抗肺孢子菌感染的作用，，而PCP患者出現(xiàn)Dectin-1受體表達(dá)下調(diào)，酵母多糖具有上調(diào)Dectin-1受體從而增強(qiáng)患者抗肺孢子菌感染的作用。但是目前為止沒有將殼聚糖和酵母多糖應(yīng)用于抗PCP研究的報(bào)道。本研究擬從殼聚糖具有抗菌作用和酵母多糖具有升高Dectin-1受體的作用為切入點(diǎn)，同時(shí)利用殼聚糖-酵母多糖微球的緩釋作用，對(duì)其抗大鼠PCP的效果進(jìn)行研究，此次研究將為殼聚糖和酵母多糖治療PCP提供理論依據(jù)。 本研究目的在于在大鼠PCP模型體內(nèi)探討殼聚糖及殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP的治療效果，并探討相關(guān)的作用機(jī)制。 方法 1.大鼠PCP模型的構(gòu)建和分組 通過每周兩次給大鼠后腿肌注地塞米松磷酸鈉的方式構(gòu)建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型構(gòu)建成功后，隨機(jī)將大鼠分為以下7組：免疫正常組、0.5%殼聚糖-免疫正常組、PCP模型組、0.1%殼聚糖組、0.5%殼聚糖組、0.2%乙酸組和Tmp-Smz組（Tmp0.0215mg/g和Smz0.11mg/g體重）。 2.在大鼠PCP模型中研究0.5%殼聚糖對(duì)PCP大鼠體重增加量、肺重、肺重/體重（lung weight/body weight，LW/BW）比率和存活率的影響藥物治療開始前和開始后分別對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，處死大鼠后稱量大鼠肺重。通過對(duì)大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，評(píng)估藥物的治療效果。 3.在大鼠PCP模型中研究0.5%殼聚糖對(duì)PCP大鼠肺組織的影響取大鼠肺組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，通過光鏡觀察各組大鼠肺組織變化和炎癥浸潤。 4.掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察各組肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)改變 取大鼠肺組織通過SEM和TEM觀察藥物對(duì)肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)破壞。 5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量 取大鼠肺組織提取總RNA，定量PCR檢測肺組織內(nèi)肺孢子菌的HSP70mRNA表達(dá)量。 6. ELISA法檢測各組大鼠血清內(nèi)IL-10、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子的含量 采集大鼠腹主動(dòng)脈血，提取血清。用ELISA法檢測藥物對(duì)血清內(nèi)IL-10、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子含量的影響。 7.使用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的含量 采集大鼠腹主動(dòng)脈血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物對(duì)大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的影響。 8.大鼠PCP模型的構(gòu)建和分組 通過每周兩次給大鼠后腿肌注地塞米松磷酸鈉的方式構(gòu)建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型構(gòu)建成功后，隨即將大鼠分為以下7組：免疫正常組、PCP模型組、0.5%殼聚糖組、0.5%殼聚糖+0.9%氯化鈉組、0.5%殼聚糖+0.5%酵母多糖組、0.5%殼聚糖+1%酵母多糖組、0.8%殼聚糖-酵母多糖微球組。 9.在PCP大鼠體內(nèi)研究0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影響 治療開始前和開始后分別對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，處死大鼠后稱量大鼠肺重。通過對(duì)大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，評(píng)估藥物的治療效果。 10.在PCP大鼠體內(nèi)研究0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織的影響 取大鼠肺組織進(jìn)行HE染色，通過光鏡觀察各組大鼠肺組織改變和炎癥浸潤。 11. TEM觀察各組肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)改變 取大鼠肺組織通過TEM觀察藥物對(duì)肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)破壞。 12.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1和TLR-4受體mRNA表達(dá)量 取大鼠肺組織提取RNA，定量PCR檢測藥物對(duì)大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1和TLR-4受體mRNA表達(dá)量的影響。 13.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量 切取大鼠肺組織提取總RNA，定量PCR檢測肺孢子菌的HSP70mRNA表達(dá)量。 14. ELISA法檢測大鼠血清內(nèi)細(xì)胞因子的含量 采取大鼠腹主動(dòng)脈血，提取血清。用ELISA法觀察藥物對(duì)血清內(nèi)IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ、MCP-1、IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子含量的影響。 結(jié)果 1.0.5%殼聚糖對(duì)PCP大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影響 0.5%殼聚糖治療后大鼠體重增加量明顯高于PCP模型組、0.2%乙酸組和0.1%殼聚糖組；0.5%殼聚糖治療后大鼠肺重和LW/BW比率明顯低于PCP模型組、0.2%乙酸組和0.1%殼聚糖組。0.5%殼聚糖治療后大鼠存活率高于PCP模型組和0.2%乙酸組。 2.0.5%殼聚糖對(duì)PCP大鼠肺組織的影響 0.5%的殼聚糖治療后，PCP大鼠肺組織內(nèi)炎細(xì)胞和巨噬細(xì)胞明顯減少，肺泡腔內(nèi)無泡沫樣物質(zhì)，而PCP模型組、0.2%乙酸組和0.1%殼聚糖組肺組織內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤并可見泡沫樣物質(zhì)形成。 3.0.5%殼聚糖對(duì)肺孢子菌超微結(jié)構(gòu)的影響 0.5%的殼聚糖治療后，電鏡下肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的破壞，可見核固縮、胞膜表面結(jié)構(gòu)不完整。 4.0.5%殼聚糖對(duì)PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量的影響 0.5%的殼聚糖治療后，PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量明顯低于PCP模型組，0.2%乙酸組和0.1%殼聚糖組。 5.0.5%殼聚糖對(duì)PCP大鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子含量的影響 0.5%的殼聚糖治療后PCP大鼠血清內(nèi)IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子的含量明顯高于PCP模型組，0.2%乙酸組和0.1%殼聚糖組，而TNF-α細(xì)胞因子的含量明顯低于PCP模型組，0.2%乙酸組和0.1%殼聚糖組。 6.0.5%殼聚糖對(duì)PCP大鼠動(dòng)脈血內(nèi)CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的影響 0.5%的殼聚糖治療后與PCP模型組、0.2%乙酸組和0.1%殼聚糖組相比明顯提高了PCP大鼠動(dòng)脈血內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞含量，與PCP模型組和0.2%乙酸組相比降低了CD8+T淋巴細(xì)胞含量。 7.0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影響 0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后與PCP模型組、0.5%殼聚糖組和0.5%殼聚糖+0.5%酵母多糖組相比明顯提高了PCP大鼠的體重增加量，并且降低了PCP大鼠的肺重和LW/BW比率。0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后大鼠存活率高于模型組。 8.0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織的影響0.8%的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后與PCP模型組、0.5%殼聚糖組和0.5%殼聚糖+0.5%酵母多糖組相比PCP大鼠肺組織內(nèi)炎細(xì)胞明顯減少。 9.0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1和TLR-4受體mRNA表達(dá)量的影響 0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后與PCP模型組、0.5%殼聚糖組和0.5%殼聚糖+0.5%酵母多糖組相比明顯提高了PCP大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1受體mRNA和降低了PCP大鼠肺部TLR-4受體mRNA的表達(dá)量。 10.0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量的影響 0.8%的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后，PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量明顯低于PCP模型組，0.5%殼聚糖組和0.5%殼聚糖+0.5%酵母多糖組。 11.0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠血清內(nèi)細(xì)胞因子的影響 0.8%的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后PCP大鼠血清內(nèi)IL-1β、IL-4、IL-10和IFN-γ細(xì)胞因子的含量明顯高于PCP模型組、0.5%殼聚糖組和0.5%殼聚糖+0.5%酵母多糖組，而IL-1α、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子的含量明顯低于PCP模型組、0.5%殼聚糖組和0.5%殼聚糖+0.5%酵母多糖組。0.8%的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后PCP大鼠血清內(nèi)MCP-1細(xì)胞因子的含量明顯高于PCP模型組，IL-2細(xì)胞因子的含量明顯低于PCP模型組。 結(jié)論 1.0.5%的殼聚糖可以減少PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量、降低LW/BW比率、減輕肺部炎癥浸潤，并且能夠增加血清內(nèi)IFN-γ、IL-10細(xì)胞因子含量和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，減少CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量和TNF-α細(xì)胞因子含量，并且還能夠引起肺孢子菌超微結(jié)構(gòu)破壞。 2.0.8%殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球可以減少PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70mRNA表達(dá)量、TLR-4受體mRNA表達(dá)量、降低LW/BW比率、減輕肺部炎癥浸潤，并且能夠增加PCP大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1受體mRNA表達(dá)量和血清內(nèi)IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ和MCP-1細(xì)胞因子含量，減少了血清內(nèi)IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子含量，并且還能夠引起肺孢子菌超微結(jié)構(gòu)破壞。
【關(guān)鍵詞】：肺孢子菌肺炎 大鼠 殼聚糖 殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.1
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-7
• 摘要7-15
• ABSTRACT15-25
• 第一部分 殼聚糖抗大鼠 PCP 的研究25-62
• 前言25-26
• 1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法26-38
• 2 結(jié)果38-52
• 3 討論52-55
• 4 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 第二部分 殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微抗大鼠 PCP 的研究62-97
• 前言62-63
• 1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法63-69
• 2 結(jié)果69-86
• 3 討論86-90
• 4 結(jié)論90-91
• 參考文獻(xiàn)91-97
• 全文總結(jié)97-98
• 文獻(xiàn)綜述98-108
• 參考文獻(xiàn)104-108
• 致謝108-109
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文109-110

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 ;Molecular phylogeny of Pneumocystis based on 5.8S rRNA gene and the internal transcribed spacers of rRNA gene sequences[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年05期

2 葉彬,鄭玉強(qiáng),武衛(wèi)華,張靜;Iron chelator daphnetin against Pneumocystis carinii in vitro[J];Chinese Medical Journal;2004年11期

3 葉彬,陳雅棠,劉成偉;青蒿素衍生物對(duì)卡氏肺孢子蟲基因的影響[J];中國人獸共患病雜志;2002年01期

4 安春麗,蘇曉平,A.G.Harmsen;CD8~+ T細(xì)胞在CD4~+ T細(xì)胞耗竭小鼠卡氏肺孢子蟲肺炎的致病作用(英文)[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2000年04期

本文編號(hào)：718211