發(fā)布時間：2017-08-22 03:00

  本文關(guān)鍵詞：二氧化氮誘導(dǎo)大鼠哮喘易感性變化的分子機制研究

  更多相關(guān)文章： 二氧化氮(NO_2) 哮喘 Th1/Th2失衡 Th2優(yōu)勢應(yīng)答 易感性 JAK/STAT6信號通路 卵蛋白(OVA)

【摘要】：近年來,隨著工業(yè)化持續(xù)快速推進、城市機動車數(shù)量迅猛增加,城市化進程不斷加快,以及煤炭、石油等能源利用迅猛增長,我國大氣污染日益嚴重,給居民健康造成了嚴重的威脅。目前我國大氣污染呈現(xiàn)出煤煙型與機動車污染共存的新型復(fù)合污染,霾和光化學(xué)煙霧頻繁及NO2濃度居高不下的狀況。NO2作為大氣污染物主要成分之一,逐漸引起了世界各國的普遍關(guān)注。監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示,城市室外NO2濃度一般不超過0.5 ppm,在交通擁堵的高峰期,可高達到4 ppm。室內(nèi)NO2污染也不容忽視,其濃度也可高達2 ppm。文獻提示,呼吸系統(tǒng)是NO2的主要毒性作用靶器官,NO2吸入后可進入下呼吸道直至肺的深部,主要引起深部呼吸道、細支氣管及肺泡損傷。因此,NO2污染與呼吸系統(tǒng)損傷和疾病的相關(guān)性引起了人們的重視。支氣管哮喘(簡稱哮喘),是由多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子共同參與的一種慢性氣道炎癥,表現(xiàn)為Th1和Th2細胞失衡及Th2細胞優(yōu)勢應(yīng)答。目前全世界支氣管哮喘患者約3億人,我國的哮喘發(fā)病率為1%,兒童高達3%。近年來,越來越多的流行病學(xué)研究表明,NO2污染與居民哮喘發(fā)病率和死亡率的增高相關(guān),特別是會使兒童哮喘發(fā)病率增加。到目前為止,NO2與哮喘的相關(guān)性研究主要集中在流行病學(xué)領(lǐng)域,且研究結(jié)果不一致,尚缺乏直接的實驗證據(jù)。此外,關(guān)于NO2誘導(dǎo)哮喘易感性變化的分子機理的實驗研究還鮮見報道。由此提出本課題,研究NO2暴露對肺的炎癥損傷效應(yīng)及其與哮喘的相關(guān)性,在此基礎(chǔ)上探討NO2誘導(dǎo)哮喘易感性增加的免疫調(diào)節(jié)機制及其可能的分子信號通路。1.本課題通過對成年正常大鼠進行動式NO2急性熏氣染毒,每天5h,連續(xù)7 d,染毒劑量為5 mg/m3,研究急性NO2吸入暴露誘導(dǎo)成年大鼠肺炎癥損傷效應(yīng)及哮喘相關(guān)基因的變化。采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測定肺組織Th2細胞因子IL-4含量,采用實時定量RT-PCR技術(shù)測定肺組織IFN-γ、Muc5ac、T-bet和GATA3 mRNA的表達。結(jié)果顯示,急性NO2吸入暴露即可誘導(dǎo)大鼠肺組織IL-4含量增加,引起肺組織Muc5ac和GATA3mRNA的表達升高及T-bet和IFN-y mRNA的表達降低。這一結(jié)果表明急性NO2吸入暴露造成T-bet/GATA3表達失衡,進而引起Thl/Th2失衡,這可能是NO2暴露引起大鼠氣道炎癥及氣道黏液高分泌的重要機制之一,同時也可能是NO2污染地區(qū)哮喘發(fā)病率逐年上升的一個重要原因。2.在日常生活中,人們對NO2的接觸往往是慢性的、低劑量的。而且哮喘本身也是一種慢性氣道炎癥反應(yīng)。然而,在慢性的、低劑量的接觸情況下NO2是否通過調(diào)控T-bet/GATA3的表達進而調(diào)控哮喘Th1/Th2失衡,最終導(dǎo)致氣道炎癥及氣道黏液高分泌等哮喘樣癥狀尚不清楚,其發(fā)生的分子機制更是鮮見報道。因此,在上一部分研究的基礎(chǔ)上,采用不同濃度NO2(2和5 mg/m3)對成年正常大鼠進行慢性吸入染毒,每天5 h,連續(xù)28 d,考察大鼠肺組織病理特征、超微結(jié)構(gòu)、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及JAK/STAT6信號通路上關(guān)鍵因子的變化,深入探討NO2對大鼠肺慢性炎癥損傷和Th1/Th2細胞失衡及其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。組織病理損傷采用常規(guī)HE染色技術(shù),超微結(jié)構(gòu)改變采用電鏡技術(shù),肺組織Th2細胞因子IL-4含量測定采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測定,肺組織IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3、T-bet、IFN-γ、IL-4α、JAKs、STAT6 mRNA表達采用實時定量RT-PCR技術(shù)測定,p-ERK1/2、p-Lck、p-NF-κB、p-STAT6蛋白表達采用Western blot技術(shù)測定。結(jié)果顯示,慢性吸入NO2可引起肺組織病理學(xué)損傷和超微結(jié)構(gòu)改變,表現(xiàn)為氣道上皮細胞破壞,支氣管壁增厚,管壁周圍可見少量炎癥細胞浸潤,氣管褶皺變厚,氣道內(nèi)可見黏液分泌；電鏡結(jié)果顯示NO2暴露組大鼠肺泡Ⅱ型細胞結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一定程度的變性,纖毛有所脫落,膠原纖維沉積現(xiàn)象嚴重。此外,與第二章急性暴露結(jié)果相一致,慢性吸入NO2同樣可以引起大鼠肺組織轉(zhuǎn)錄因子GATA3表達上調(diào),T-bet表達下調(diào),Th2細胞因子IL-4的分泌增加,Thl細胞因子IFN-y表達減少,同時炎性因子IL-1β、黏附分子ICAM-1和黏蛋白基因Muc5ac mRNA表達量也增加,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,即使在低濃度暴露組(2mg/m3)也表現(xiàn)出損傷效應(yīng)；此外,JAK/STAT6信號傳導(dǎo)通路中IL-4Rα、JAK1和STAT6表達增加,STAT6、NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白的磷酸化水平顯著上升,且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明,慢性NO2吸入暴露可引起正常大鼠肺組織相關(guān)基因出現(xiàn)與哮喘患者類似的改變,如Th2細胞因子、黏蛋白基因、粘附因子發(fā)生濃度依賴性上調(diào),Th1胞因子下調(diào),在此過程中激活了大鼠肺組織JAK/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白,進而調(diào)控Th1/Th2細胞因子的分泌,導(dǎo)致機體Th1/Th2失衡及呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢應(yīng)答。本實驗通過N02慢性吸入暴露模型進一步證明N02暴露可以引起機體Th1/Th2失衡及Th2優(yōu)勢應(yīng)答,并且JAK/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERK1/2和Lck參與了調(diào)控。由此提示NO2暴露人群可能較正常人更易患哮喘,以上途徑可能是NO2暴露引起氣道炎癥反應(yīng)的重要機制之一。3.為了進一步探討NO2誘導(dǎo)哮喘易感性增加的可能分子機制,本實驗通過建立成年大鼠哮喘模型,觀察NO2對哮喘大鼠肺組織病理特征、超微結(jié)構(gòu)、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及JAK/STAT6信號通路上關(guān)鍵因子的影響。動物染毒處理：實驗用Wistar雄性大鼠(鼠齡為42 d)隨機分為3組,分別為對照組、OVA組和NO2+OVA組。首先,NO2+OVA組大鼠暴露于濃度為5mg/m3的NO2,每天5 h,對照組和OVA組暴露于過濾的新鮮空氣中5 h,連續(xù)42 d；其次,OVA組和N02+OVA組在熏氣第22 d、29 d分別腹腔注射10%OVA和10%氫氧化鋁混合液1mL致敏,第36 d開始連續(xù)7 d 1%OVA超聲波霧化激發(fā)(20 mind)。采用常規(guī)HE染色和電鏡技術(shù)分別考察肺組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變,采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測定肺組織IL-4和血清OVA特異性IgE含量,采用實時定量RT-PCR技術(shù)測定IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3、T-bet、WN-γ、IL-4α、 JAKs、STAT6 mRNA表達,采用Western blot技術(shù)測定p-ERK1/2、p-Lck、p-NF-icB、 P-STAT6蛋白表達。結(jié)果顯示,NO2吸入暴露加重哮喘大鼠肺組織炎性細胞浸潤、氣道黏液分泌等病理學(xué)改變及膠原纖維增生、纖毛脫落等超微結(jié)構(gòu)改變；N02吸入暴露促進哮喘大鼠IL-4、IL-1β、ICAM-1、Muc5ac、GATA3表達及血清OVA特異性IgE含量持續(xù)增加,而IFN-γ、T-bet表達進一步減少；NO2暴露促進哮喘大鼠肺組織JAK/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERK1/2和Lck蛋白的激活水平。以上結(jié)果表明,NO2暴露增加成年大鼠哮喘易感性,其可能通過促進T-bet/GATA3比例失調(diào),加重Th1/Th2偏移,進而調(diào)控Th1/Th2細胞因子的分泌,同時誘導(dǎo)JAK/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控因子NF-κB、ERκ1/2和Lck激活水平上升,從而加重哮喘的炎癥反應(yīng)和過敏性反應(yīng),這可能是暴露于NO2的人群更敏感、更易患哮喘,其發(fā)生哮喘時的反應(yīng)更嚴重的重要機制之一,同時也證實NO2污染是哮喘發(fā)病率增加的一個重要誘因。4.流行病學(xué)研究顯示,NO2暴露對不同年齡的人群所誘導(dǎo)的哮喘癥狀不同,其哮喘發(fā)作程度也不同。兒童發(fā)病率較成年人更高,作者推測兒童可能較成年人更敏感,更易發(fā)生哮喘或哮喘發(fā)作程度更嚴重。因此,本實驗通過建立幼年大鼠哮喘模型,驗證NO2暴露是否通過與成年人相同的機制誘導(dǎo)兒童哮喘易感性增加。實驗用Wistar雄性大鼠(鼠齡為21 d)隨機分為3組,分別為對照組、OVA組和NO2+OVA組。動物染毒處理和實驗方法同第三部分。結(jié)果顯示,通過比較NO2暴露下幼年和成年哮喘大鼠的上述指標后發(fā)現(xiàn),幼年大鼠上述指標的變化較成年大鼠更明顯,提示幼年大鼠對NO2更敏感,損傷效應(yīng)更嚴重,這一結(jié)果解釋了作者之前的推測,這可能是NO2污染地區(qū)兒童比成年人哮喘發(fā)病率高的一個重要原因。5.研究發(fā)現(xiàn),哮喘兒童外周血淋巴細胞DNA斷裂程度增加,可能與哮喘患者機體ROS過量積累所導(dǎo)致的氧化損傷有關(guān)。而N02本身能否引起哺乳動物DNA損傷,進而影響哮喘疾病的發(fā)生發(fā)展,尚未見文獻報道。為此,本研究通過建立整體動物染毒模型,研究了NO2吸入誘導(dǎo)大鼠DNA損傷效應(yīng),旨在探討其誘導(dǎo)哮喘易感性變化的可能原因。結(jié)果顯示,NO2急性和慢性吸入暴露均可導(dǎo)致大鼠肺細胞DNA斷裂程度增加、DPC系數(shù)上升及骨髓微核發(fā)生率升高,且存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。說明NO2吸入暴露可誘導(dǎo)機體遺傳物質(zhì)受損,其可能與自由基氧化損傷有關(guān),這可能是NO2暴露誘導(dǎo)哮喘易感性增加的一個重要原因。本研究闡明了NO2對肺的炎癥損傷效應(yīng),確立了NO2暴露與哮喘發(fā)生的相關(guān)性及其分子機制,并建立了NO2暴露風險評價的效應(yīng)標記；在此基礎(chǔ)上進一步明確了NO2誘導(dǎo)哮喘(尤其是兒童哮喘)易感性增加的分子機制及其可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為污染地區(qū)患者尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：二氧化氮(NO_2) 哮喘 Th1/Th2失衡 Th2優(yōu)勢應(yīng)答 易感性 JAK/STAT6信號通路 卵蛋白(OVA)
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25;X51
【目錄】：

• 中文摘要15-19
• ABSTRACT19-26
• 第一章 文獻綜述26-48
• 1.1 二氧化氮的健康效應(yīng)研究進展26-35
• 1.1.1 NO_2污染現(xiàn)狀26-29
• 1.1.2 NO_2的流行病學(xué)和毒理學(xué)研究進展29-35
• 1.2 哮喘發(fā)病機理研究進展35-45
• 1.2.1 概述35-39
• 1.2.2 哮喘發(fā)病機理39-43
• 1.2.3 JAK/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與哮喘研究進展43-45
• 1.3 本課題的立題依據(jù)及研究內(nèi)容45-48
• 1.3.1 本課題的目的和意義45-47
• 1.3.2 課題的研究內(nèi)容47-48
• 第二章 急性吸入NO_2誘導(dǎo)成年大鼠肺炎癥損傷效應(yīng)48-56
• 2.1 前言48
• 2.2 材料與方法48-51
• 2.2.1 主要試劑與儀器48-49
• 2.2.2 NO_2動態(tài)吸入染毒處理49
• 2.2.3 IL-4的ELISA檢測49
• 2.2.4 實時定量RT-PCR測定mRNA表達水平49-51
• 2.2.5 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理51
• 2.3 結(jié)果51-53
• 2.3.1 急性吸入NO_2對大鼠肺組織Muc5ac mRNA表達的影響51-52
• 2.3.2 急性吸入NO_2對大鼠肺組織炎癥因子IL-4和IFN-γ的影響52
• 2.3.3 急性吸入NO_2對大鼠肺組織T-bet/GATA3 mRNA表達的影響52-53
• 2.4 討論與結(jié)論53-56
• 第三章 慢性吸入NO_2誘導(dǎo)成年大鼠肺炎癥反應(yīng)及其與Th1/Th2失衡的關(guān)系56-73
• 3.1 前言56-57
• 3.2 材料與方法57-61
• 3.2.1 主要試劑與儀器57-58
• 3.2.2 NO_2動態(tài)吸入染毒處理58
• 3.2.3 組織病理學(xué)HE檢測58-59
• 3.2.4 肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察59
• 3.2.5 IL-4的ELISA檢測59
• 3.2.6 實時定量RT-PCR測定mRNA表達水平59-60
• 3.2.7 Western blot方法測定目的蛋白的表達60-61
• 3.2.8 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理61
• 3.3 結(jié)果61-69
• 3.3.1 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織病理學(xué)的影響61-62
• 3.3.2 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)的影響62
• 3.3.3 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織Muc5ac mRNA表達的影響62-63
• 3.3.4 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織IL-1β和ICAM-1 mRNA表達的影響63-64
• 3.3.5 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織IL-4和IFN-γ表達的影響64-65
• 3.3.6 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織T-bet/GATA3 mRNA表達的影響65-66
• 3.3.7 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織IL-4Rα和JAK1 mRNA表達的影響66
• 3.3.8 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織STAT6表達的影響66-68
• 3.3.9 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織NF-κB蛋白激活的影響68
• 3.3.10 慢性吸入NO_2對大鼠肺組織ERK1/2和Lck蛋白激活的影響68-69
• 3.4 討論與結(jié)論69-73
• 第四章 NO_2誘導(dǎo)成年大鼠哮喘易感性增加的分子機制研究73-89
• 4.1 前言73
• 4.2 材料與方法73-75
• 4.2.1 主要試劑與儀器73
• 4.2.2 動物染毒處理73-74
• 4.2.3 支氣管肺泡灌洗及細胞分類計數(shù)74
• 4.2.4 組織病理學(xué)HE檢測74
• 4.2.5 肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察74
• 4.2.6 IL-4和OVA特異性IgE的ELISA檢測74
• 4.2.7 實時定量RT-PCR測定mRNA表達水平74
• 4.2.8 Western blot方法測定目的蛋白的表達74
• 4.2.9 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理74-75
• 4.3 結(jié)果75-85
• 4.3.1 各組成年大鼠臨床表現(xiàn)75
• 4.3.2 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織病理學(xué)的影響75
• 4.3.3 NO_2對成年哮喘大鼠BALF中白細胞百分比的影響75-76
• 4.3.4 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)的影響76-77
• 4.3.5 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織Muc5ac mRNA表達的影響77-78
• 4.3.6 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織IL-1β和ICAM-1 mRNA表達的影響78-79
• 4.3.7 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織IL-4和IFN-γ表達的影響79
• 4.3.8 NO_2對成年哮喘大鼠血清OVA特異性IgE含量的影響79-80
• 4.3.9 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織T-bet/GATA3 mRNA表達的影響80-81
• 4.3.10 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織IL-4Rα和JAKs mRNA表達的影響81-82
• 4.3.11 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織STAT6表達的影響82-84
• 4.3.12 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織NF-κB蛋白激活的影響84
• 4.3.13 NO_2對成年哮喘大鼠肺組織ERK1/2和Lck蛋白激活的影響84-85
• 4.4 討論與結(jié)論85-89
• 第五章 NO_2誘導(dǎo)幼年大鼠哮喘易感性增加的分子機制研究89-104
• 5.1 前言89
• 5.2 材料與方法89-90
• 5.2.1 主要試劑與儀器89
• 5.2.2 動物染毒處理89-90
• 5.2.3 支氣管肺泡灌洗及細胞分類計數(shù)90
• 5.2.4 組織病理學(xué)HE檢測90
• 5.2.5 肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察90
• 5.2.6 IL-4和OVA特異性IgE的ELISA檢測90
• 5.2.7 實時定量RT-PCR測定mRNA表達水平90
• 5.2.8 Western blot方法測定目的蛋白的表達90
• 5.2.9 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理90
• 5.3 結(jié)果90-102
• 5.3.1 各組幼年大鼠臨床表現(xiàn)90
• 5.3.2 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織病理學(xué)的影響90-91
• 5.3.3 NO_2對幼年哮喘大鼠BALF中白細胞百分比的影響91-92
• 5.3.4 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)的影響92-93
• 5.3.5 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織Muc5ac mRNA表達的影響93-94
• 5.3.6 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織IL-1β和ICAM-1 mRNA表達的影響94-95
• 5.3.7 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織IL-4和IFN-γ表達的影響95
• 5.3.8 NO_2對幼年哮喘大鼠血清OVA特異性IgE含量的影響95-96
• 5.3.9 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織T-bet/GATA3 mRNA表達的影響96-97
• 5.3.10 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織IL-4Rα和JAKs mRNA表達的影響97-98
• 5.3.11 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織STAT6表達的影響98-100
• 5.3.12 NO_2對幼年哮喘大鼠肺組織NF-κB蛋白激活的影響100-101
• 5.3.13 NO_2對幼年大鼠肺組織ERK1/2和Lck蛋白激活的影響101
• 5.3.14 NO_2暴露下成年大鼠與幼年大鼠哮喘特征性指標的比較101-102
• 5.4 討論與結(jié)論102-104
• 第六章 NO_2暴露對大鼠的遺傳毒性研究104-111
• 6.1 前言104
• 6.2 材料與方法104-106
• 6.2.1 主要試劑與儀器104-105
• 6.2.2 實驗大鼠NO_2動態(tài)吸入染毒處理105
• 6.2.3 DNA斷裂程度檢測105-106
• 6.2.4 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)系數(shù)的測定106
• 6.2.5 微核測定106
• 6.2.6 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理106
• 6.3 結(jié)果106-109
• 6.3.1 急性NO_2暴露對大鼠的遺傳毒性106-108
• 6.3.2 慢性NO_2暴露對大鼠的遺傳毒性108-109
• 6.4 討論與結(jié)論109-111
• 第七章 結(jié)論111-113
• 7.1 急性NO_2吸入暴露誘導(dǎo)成年大鼠肺組織氣道炎癥反應(yīng),引起Th1/Th2失衡111
• 7.2 慢性NO_2吸入暴露誘導(dǎo)Th1/Th2失衡及Th2優(yōu)勢應(yīng)答,并且JAK/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了調(diào)控111
• 7.3 NO_2吸入誘導(dǎo)哮喘大鼠易感性增加,且幼年期更敏感,其機制涉及促進Th1/Th2失衡及JAK/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度活化111-112
• 7.4 NO_2吸入對大鼠DNA造成損傷112-113
• 參考文獻113-128
• 致謝128-129
• 附錄129-132
• 博士研究生期間發(fā)表的論文129-130
• 參編著作130-131
• 主持和參與科研項目131-132
• 個人簡況132-134

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李敏然,鄭勁平;氣道高反應(yīng)性測定的現(xiàn)代臨床進展[J];國外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊;1998年01期

2 王少利,郭新彪,張金良;北京市大氣污染對學(xué)齡兒童呼吸系統(tǒng)疾病和癥狀的影響[J];環(huán)境與健康雜志;2004年01期

3 蔡萌;龐興龍;;機動車氮氧化物污染現(xiàn)狀與減排措施[J];北方環(huán)境;2013年06期

4 郝吉明;程真;王書肖;;我國大氣環(huán)境污染現(xiàn)狀及防治措施研究[J];環(huán)境保護;2012年09期

5 閆靜;王文川;楊g，

本文編號：716649