本文關(guān)鍵詞：COPD動(dòng)態(tài)miRNA表達(dá)譜的構(gòu)建及血清miRNA分子標(biāo)志物的篩選與鑒定

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【摘要】：背景：COPD是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,其發(fā)病率逐年增高與吸煙和大氣污染日益嚴(yán)重相關(guān)。COPD主要特征包括慢性支氣管炎和肺氣腫,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限和肺部異常炎癥反應(yīng)。COPD患者病情反復(fù)急性加重可以增加發(fā)病率和死亡率。吸煙是COPD發(fā)病最重要的危險(xiǎn)因素,與95%的COPD發(fā)病有關(guān)。然而早期COPD患者缺乏特異性癥狀,目前尚無(wú)公認(rèn)COPD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子標(biāo)志物,因此在COPD患者和高危人群中尋找分子標(biāo)志物,有助于COPD的早期防治。miRNAs是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA,通過(guò)與靶基因3’端非翻譯區(qū)結(jié)合發(fā)揮抑制翻譯作用或?qū)е耺RNA完全降解。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種miRNAs,可參與調(diào)節(jié)許多重要生物學(xué)過(guò)程如：發(fā)育、凋亡、細(xì)胞增殖、造血等。miRNA在血清及血漿中非常穩(wěn)定地存在,可以抵抗內(nèi)源性RNA酶,在多種儲(chǔ)存條件和反復(fù)凍融情況下亦可保持穩(wěn)定。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA可能成為一些疾病的分子標(biāo)志物如：肺癌、胃癌、敗血癥和肺結(jié)核等。目前在COPD發(fā)展過(guò)程中血清miRNA的相關(guān)研究甚少,僅一項(xiàng)土耳其小樣本研究發(fā)現(xiàn)COPD外周血清存在miRNA表達(dá)異常,且miRNA在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮何種作用仍不清楚,血清miRNA是否可能成為COPD早期診斷標(biāo)志物,有賴于進(jìn)一步深入研究。 目的：本研究擬通過(guò)建立COPD動(dòng)態(tài)大鼠模型,了解肺部病理改變,同時(shí)對(duì)COPD不同時(shí)期大鼠肺組織進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析,將差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析。并在此基礎(chǔ)上,選擇差異表達(dá)miRNA在COPD患者外周血清中進(jìn)行檢測(cè),以尋找COPD早期診斷分子標(biāo)志物。 方法：1、將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,包括對(duì)照組、吸煙2周組、吸煙4周組、吸煙6周組、吸煙8周組、吸煙15周+氣管內(nèi)滴注豬胰彈性蛋白酶組,每組各5只,建立香煙誘導(dǎo)COPD動(dòng)態(tài)大鼠模型,同時(shí)進(jìn)行病理學(xué)觀察其形態(tài)學(xué)改變。2、取對(duì)照組、吸煙4周組、吸煙15周+氣管內(nèi)滴注豬胰彈性蛋白酶組大鼠肺組織各2例用于miRNA表達(dá)譜芯片分析。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)異常表達(dá)miRNA,驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)。4、運(yùn)用生物信息學(xué)法對(duì)miRNA表達(dá)譜進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、聚類分析及GO和Pathway分析。5、將研究對(duì)象分為健康對(duì)照組、重度吸煙組、COPD組,共收集各組外周血清及臨床資料。6、運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組外周血清miR-21、miR-181a、miR-146a表達(dá)水平。7、對(duì)血清miR-21、miR-181a表達(dá)進(jìn)行ROC分析。 結(jié)果：1、成功建立COPD動(dòng)態(tài)大鼠模型,大鼠肺組織出現(xiàn)早期以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主晚期出現(xiàn)肺氣腫改變的動(dòng)態(tài)病理變化。2、成功建立miRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)譜,在熏煙4周組共有30個(gè)miRNAs異常表達(dá),熏煙15周組共有37個(gè)miRNAs異常表達(dá)。3、對(duì)表達(dá)差異較明顯的6個(gè)miRNAs進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示miR-206、miR-146a、 miR-147、miR-21、miR-181a和miR-92a-2*的變化趨勢(shì)與miRNA芯片數(shù)據(jù)一致,證實(shí)了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。4、生物信息學(xué)分析顯示異常表達(dá)的miRNA可能與COPD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。5、共收集健康對(duì)照組41名、重度吸煙組40名、COPD組49名,重度吸煙組和COPD組外周血清miR-21較正常組增高,而miR-181a表達(dá)水平較正常組較低。COPD外周血清miR-21、miR-181a變化與肺功能相關(guān)。6、ROC分析結(jié)果顯示血清miR-21/miR-181a具有較高敏感性(85.4%)和特異性(85.0%),曲線下面積0.910(95%CI：0.846-0.974),有望成為COPD早期診斷的分子標(biāo)志物。 結(jié)論：1、成功建立動(dòng)態(tài)COPD大鼠模型及miRNA表達(dá)譜。2、通過(guò)生物信息學(xué)分析異常表達(dá)的1niRNA(miR-206、miR-146a、miR-147、 miR-21、miR-181a和miR-92a-2*)可能在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。3、聯(lián)合檢測(cè)外周血清miR-21和miR-181a的表達(dá)水平并計(jì)算二者比值,可能成為COPD早期診斷新的分子標(biāo)志物。圖26幅,表7個(gè),參考文獻(xiàn)125篇。
【關(guān)鍵詞】：慢性阻塞性肺疾病 血清miRNA 微芯片 分子標(biāo)志物 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 符號(hào)說(shuō)明12-14
• 前言14-16
• 第一部分 動(dòng)態(tài)COPD大鼠模型的建立與miRNA表達(dá)譜的構(gòu)建16-44
• 1 前言16-19
• 2 材料和方法19-27
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.1.2 主要儀器19
• 2.1.3 主要試劑19-20
• 2.1.4 RNA操作用品的處理20
• 2.1.5 主要試劑配制20-21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 COPD動(dòng)態(tài)大鼠構(gòu)建及病理學(xué)觀察21-23
• 2.2.2 miRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)23-25
• 2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)25-26
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 3 結(jié)果27-37
• 3.1 動(dòng)態(tài)COPD大鼠模型評(píng)價(jià)27-28
• 3.1.1 一般狀態(tài)27
• 3.1.2 體重變化27
• 3.1.3 肺功能檢查27-28
• 3.2 動(dòng)態(tài)COPD大鼠模型肺組織病理學(xué)特征28-31
• 3.2.1 光鏡下組織病理切片特征28-30
• 3.2.2 炎癥病理評(píng)分30-31
• 3.3 動(dòng)態(tài)COPD大鼠模型miRNA芯片表達(dá)譜31-35
• 3.3.1 組織樣本的總RNA提取及質(zhì)量鑒定31-32
• 3.3.2 動(dòng)態(tài)miRNA芯片表達(dá)譜構(gòu)建32-35
• 3.4 芯片結(jié)果驗(yàn)證35-37
• 4 討論37-42
• 4.1 動(dòng)態(tài)COPD大鼠模型的構(gòu)建37-38
• 4.2 動(dòng)態(tài)COPD大鼠模型miRNA芯片表達(dá)譜38-40
• 4.3 miRNA芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證40-42
• 5 結(jié)論42-44
• 第二部分 COPD動(dòng)態(tài)miRNA表達(dá)譜的生物信息學(xué)研究44-72
• 1 前言44-46
• 2 材料和方法46-49
• 2.1 材料(分析軟件及數(shù)據(jù)庫(kù))46
• 2.1.1 聚類分析軟件46
• 2.1.2 靶基因預(yù)測(cè)46
• 2.1.3 GO和Pathway分析46
• 2.2 方法46-49
• 2.2.1 分層聚類分析46-47
• 2.2.2 差異表達(dá)miRNA splinecluster聚類分析47
• 2.2.3 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)47
• 2.2.4 基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析47-48
• 2.2.5 信號(hào)通路(Pathway)分析48-49
• 3 結(jié)果49-63
• 3.1 分層聚類分析49-51
• 3.2 差異表達(dá)miRNA splinecluster聚類分析51-55
• 3.3 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)55-58
• 3.4 基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析58-61
• 3.5 信號(hào)通路(Pathway)分析61-63
• 4 討論63-70
• 4.1 miRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)譜的聚類分析63-64
• 4.2 miRNA靶基因預(yù)測(cè)64-65
• 4.3 miRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)譜的GO和Pathway分析65-70
• 4.3.1 MAPK signaling pathway67-68
• 4.3.2 TGF-beta signaling pathway68
• 4.3.3 Cytokine-cytokine receptor interaction68-69
• 4.3.4 Wnt signaling pathway69-70
• 5 結(jié)論70-72
• 第三部分 COPD患者血清miRNA分子標(biāo)志物的篩選與鑒定72-92
• 1 前言72-75
• 2 材料和方法75-78
• 2.1 材料75
• 2.1.1 試劑75
• 2.1.2 儀器75
• 2.2 方法75-78
• 2.2.1 研究對(duì)象75-76
• 2.2.2 研究對(duì)象人口學(xué)特征及肺功能76
• 2.2.3 血清采集及處理76
• 2.2.4 血清miRNA提取76-77
• 2.2.5 候選miRNA篩選77
• 2.2.6 miRNA逆轉(zhuǎn)錄77
• 2.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)血清miRNA77
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法77-78
• 3 結(jié)果78-86
• 3.1 研究對(duì)象人口學(xué)和臨床特征調(diào)查78
• 3.2 血清miRNA候選分子標(biāo)志物篩選78-80
• 3.3 COPD患者外周血清miR-21,miR-181a和miR-146a的表達(dá)80-82
• 3.4 COPD患者外周血清miR-21,miR-181a表達(dá)水平與肺功能的關(guān)系82-83
• 3.5 COPD患者血清miR-21,miR-181a的ROC分析83-86
• 4 討論86-91
• 4.1 COPD診療現(xiàn)狀86
• 4.2 循環(huán)miRNA有望成為多種疾病的分子標(biāo)志物86-87
• 4.3 COPD相關(guān)血清miRNA的表達(dá)87-88
• 4.4 COPD相關(guān)異常表達(dá)的血清miRNA作用與意義88-90
• 4.4.1 miR-2188-89
• 4.4.2 miR-181a89-90
• 4.5 血清miRNA-21和miR-181a表達(dá)水平的ROC分析90-91
• 5 結(jié)論91-92
• 參考文獻(xiàn)92-103
• 綜述103-115
• 參考文獻(xiàn)110-115
• 攻讀學(xué)位期間主要成果115-116
• 致謝116

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 來(lái)茂德;醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的生物信息學(xué)應(yīng)用[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年02期

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本文編號(hào)：716788