本文關(guān)鍵詞：重組CC16蛋白質(zhì)對COPD炎癥作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.重組蛋白CC16的誘導表達和純化。2.觀察r CC16蛋白質(zhì)對脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞炎癥介質(zhì)表達的抑制作用。3.研究重組CC16蛋白質(zhì)對COPD小鼠模型肺部炎癥反應的作用及其對支氣管灌洗液中與血清IL-6、TNF-a、IL-8、IL-1β表達的影響。4.研究重組CC16蛋白質(zhì)對COPD模型組肺組織氣道上皮中CC16、NF-κB、MMP-9、TIMP-1、ICAM-1表達的影響。方法:1.將成功構(gòu)建的p ET-30a(+)-r CC16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞BL21中,經(jīng)IPTG誘導表達,Ni+-NTA樹脂親和純化,Western blotting檢測分析純化的重組CC16蛋白。去內(nèi)毒素后得到實驗用的重組r CC16蛋白質(zhì)。2.通過檢測PLA2的活性,從而判斷r CC16蛋白質(zhì)是否具有生物活性。將不同濃度(0、0.5、1、2.5μg/m L)的重組CC16作用于小鼠巨噬細胞(RAW264.7),共同培養(yǎng)1、2、3、4、5天,通過CCK-8檢測RAW264.7細胞的增殖,明確重組r CC16對RAW264.7細胞的毒理作用。3.不同濃度重組CC16(0、0.5、1、2.5μg/m L)預干預RAW264.7細胞2小時后,LPS(0.1μg/m L)刺激RAW264.7細胞,24小時后收集上清,采用ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白水平。4.采用被動吸入香煙煙霧結(jié)合鼻腔滴入LPS法復制小鼠COPD模型,實驗組小鼠給予不同濃度重組r CC16蛋白質(zhì)(1、2.5μg/m L體重r CC16,即低劑量組與高劑量組)進行滴鼻干預,1月后行HE染色觀察r CC16干預組小鼠肺組織的病理變化,進而檢測重組r CC16對COPD是否有干預作用。收集COPD小鼠和r CC16干預組小鼠BALF和血清,ELISA方法檢測TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的表達,明確重組CC16對COPD小鼠炎性介質(zhì)表達的干預作用。5.取COPD小鼠和r CC16干預組小鼠的肺組織切片,免疫組織化學法檢測CC16、NF-κB、MMP-9、ICAM-1、TIMP-1的表達,進一步明確重組CC16對COPD小鼠的的干預作用及可能的機制。結(jié)果:1.SDS-PAGE結(jié)果顯示,獲得純度高于95%的重組r CC16蛋白質(zhì);Western blotting結(jié)果表明,r CC16可被抗CC16抗體特異性的識別。2.(1)0.5μg/m L r CC16可抑制PLA2的活性,且隨著r CC16劑量的增加(1.0、2.0μg/m L),抑制作用越明顯。提示獲得的r CC16具有生物活性。(2)5μg/m L以下劑量r CC16對RAW264.7細胞增殖及活力無明顯影響。5μg/m L劑量組細胞的吸光度值明顯降低,提示該劑量的r CC16對RAW264.7細胞的增殖有抑制作用。3.不同濃度重組CC16(0、0.5、1、2.5μg/m L)干預RAW264.7細胞2小時后LPS(0.1μg/m L)刺激RAW264.7細胞24小時,收集上清,ELISA檢測結(jié)果:(1)LPS刺激RAW264.7細胞24 h后,收集細胞上層培養(yǎng)液,檢測TNF-α含量:LPS組相比照組明顯升高(對照組:85.76±13.41 ng/L,LPS組:443.77±20.70 ng/L)(P0.01)。預先給予不同濃度的重組r CC16干預后,檢測LPS刺激RAW264.7細胞24h后上清液中TNF-α含量:與LPS組相比,r CC16(1.0μg/m L、2.0μg/m L)組明顯降低(1.0μg/m L組:372.73±25.38 ng/L,2.0μg/m L組:357.02±24.84 ng/L)(P0.01),且隨著r CC16劑量的增加TNF-α含量減少的越明顯。(2)LPS刺激RAW264.7細胞24 h后,收集細胞上清液,檢測IL-8含量:LPS組相比對照組明顯升高(對照組23.55±8.55 pg/m L,LPS組82.66±9.76 pg/m L)(P0.01)。預先給予不同濃度的重組r CC16干預后,檢測LPS刺激RAW264.7細胞24h后上清液中IL-8含量,與LPS組相比,2.0μg/m L r CC16干預組IL-8表達下降(60.30±8.09 pg/m L)(P0.05),其余兩組則沒有統(tǒng)計學意義(0.5μg/m L組:76.34±8.34 pg/m L,1.0μg/m L組:69.03±10.45 pg/m L)(P0.05)。(3)LPS刺激RAW264.7細胞24 h后,收集細胞上清液,檢測IL-6含量:LPS組相比對照組明顯升高(對照組21.02±6.00 pg/m L,LPS組128.96±5.94 pg/m L)(P0.01)。預先給予不同濃度的重組r CC16干預后,檢測LPS刺激RAW264.7細胞24h后上清液中IL-6含量:與LPS組相比,各劑量組均可以降低LPS誘導的IL-6的表達,(0.5μg/m L組:111.27±6.37 pg/m L,P0.05;1.0μg/m L組:95.22±10.63pg/m L,P0.01;2.0μg/m L組:57.38±14.26 pg/m L,P0.01)。(4)LPS刺激RAW264.7細胞24 h后,收集細胞上清液,檢測不同劑量r CC16對IL-1β的影響,結(jié)果顯示,各劑量組均無對IL-1β的表達無作用(對照組:17.46±1.09 ng/L,LPS組:21.08±4.16 ng/L,0.5μg/m L組:16.44±1.73 ng/L,1.0μg/m L組:16.33±1.41 ng/L,2.0μg/m L組:15.36±1.79 ng/L,P值均大于0.05)。4.采用被動吸煙聯(lián)合鼻腔滴入LPS法復制小鼠COPD模型,同時給予不同濃度重組r CC16(1、2.5μg/g體重r CC16,即低劑量組與高劑量組)進行滴鼻干預,未干預組和PBS滴鼻組作為實驗對照。(1)HE染色結(jié)果顯示:COPD小鼠模型組其肺泡的完整結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的破壞,進而聚集融合形成了較大的肺大泡,氣道黏膜褶皺增多,纖毛脫落,官腔變窄。應用重組r CC16蛋白質(zhì)干預后,上述癥狀有所改善。肺大泡的形成較COPD組明顯減少,官腔逐漸恢復正常形態(tài),且高劑量組較低劑量組的作用明顯。(2)收集肺泡灌洗液和血清,ELISA方法檢測TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的表達。結(jié)果顯示:與正常對照組相比較,COPD組模型組血清和灌洗液中的TNF-α含量明顯升高(正常組血清:61.12±13.37 ng/L,正常組灌洗液:67.57±18.03 ng/L,COPD組血清:116.04±12.10 ng/L,COPD組灌洗液:138.69±19.74 ng/L)(P0.05)。給予不同濃度的重組r CC16干預后,高劑量組血清中的TNF-α與COPD組相比較含量明顯減少(高劑量組血清:66.37±18.50 ng/L)(P0.01);灌洗液中TNF-α的含量與COPD組相比較含量明顯減少(灌洗液低劑量組:109.05±10.94ng/L,灌洗液高劑量組:97.55±17.76 ng/L)(P0.01),且隨著r CC16濃度的增加,TNF-α含量減少;與正常對照組相比較,COPD組血清和灌洗液中的IL-6含量明顯增多(正常組血清:69.12±5.21 pg/m L,正常組灌洗液:20.70±5.23 pg/m L,COPD組血清:179.90±9.46 pg/m L,COPD組灌洗液:69.04±9.64 pg/m L)(P0.01)。給予不同濃度的重組r CC16干預后,結(jié)果顯示,灌洗液中和血清中的IL-6與COPD組相IV比較均有統(tǒng)計學意義(灌洗液低劑量組:51.28±11.94 pg/m L,灌洗液高劑量組:43.04±8.63 pg/m L:血清低劑量組:146.80±8.58 pg/m L,血清高劑量組:106.64±5.26 pg/m L)(P0.05),且隨著r CC16濃度的增加,IL-6含量減少;與正常對照組相比較COPD組血清和灌洗液中的IL-8含量明顯升高(正常組血清:96.35±9.70 pg/m L,正常組灌洗液:63.54±7.69 pg/m L,COPD組血清:157.60±19.31pg/m L,COPD組灌洗液:133.25±7.29 pg/m L)(P0.01)。給予不同濃度的重組r CC16干預后,灌洗液中IL-8與COPD組相比較均有統(tǒng)計學意義(灌洗液低劑量組:89.24±9.25 pg/m L,灌洗液高劑量組:62.07±6.75 pg/m L)(P0.01),且隨著r CC16濃度的增加,IL-8含量減少。血清中IL-8與COPD組相比,高劑量組有統(tǒng)計學意義(血清高劑量組:113.73±5.75 pg/m L);與正常對照組相比較COPD組血清中的IL-1β含量明顯升高(正常組血清:91.02±9.82 pg/m L,COPD組血清:118.49±15.18 pg/m L)(P0.01)。給予不同濃度的重組r CC16干預后,灌洗液中和血清中的IL-1β與COPD組相比較均沒有意義(血清低劑量組:116.96±8.42 ng/L,血清高劑量組;109.90±6.79 ng/L灌洗液低劑量組:127.99±18.47 ng/L灌洗液高劑量組:118.15±10.96 ng/L)(P0.05)。5.免疫組化:小鼠肺組織氣道上皮中CC16、MMP-9、TIMP-1、ICAM-1的表達水平用灰度值表示,灰度值越大,表達水平越低。小鼠肺組織氣道上皮中NF-κB p65的表達用入核陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)所得的百分比表示,百分比越大,入核表達越強。COPD組的小鼠肺組織氣道上皮中的CC16的含量較正常組明顯減少(正常組平均灰度值為178.61±1.58,COPD組平均灰度值為196.05±2.30)(P0.05)。而COPD組中的MMP-9、TIMP-1、ICAM-1的表達較正常組均高。差異均具有統(tǒng)計學意義(正常組MMP-9平均灰度值:201.08±3.03,COPD組MMP-9平均灰度值:148.17±2.12;正常組TIMP-1平均灰度值:206.09±1.93,COPD組TIMP-1平均灰度值:176.27±1.79;正常組ICAM-1平均灰度值:193.67±2.88,COPD組ICAM-1平均灰度值:176.35±1.94)(P0.05)。隨著r CC16的干預,高劑量組干預組肺組織中的CC16的含量有所增加(高劑量組平均灰度值:181.59±3.12,P0.01),MMP-9的表達隨著r CC16濃度的增加而下降,呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系(低劑量組:164.93±1.92,高劑量組:178.77±2.38,P0.05);TIMP-1、ICAM-1的表達隨著r CC16的干預較COPD組有所減少,但高劑量組與低劑量組沒有差異(低劑量TIMP-1組:197.43±2.04,高劑量TIMP-1組:195.03±2.21;低劑量ICAM-1組:190.82±3.87,高劑量ICAM-1組:186.69±3.12,P0.05)。與正常相比較,COPD組小鼠肺組織氣道上皮中NF-κB p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)移,入核明顯增多(正常組:20.32±1.98,COPD組:48.02±4.70,P0.05),隨著r CC16的干預,干預組肺組織細胞核中的NF-κB p65含量減少,且有一定的劑量依賴關(guān)系,差異具有統(tǒng)計學意義(低劑量組:38.92±3.27;高劑量組:31.79±2.02,P0.05)。結(jié)論:1.純化的重組r CC16蛋白質(zhì)具有生物活性,5μg/m L的濃度以下對細胞的活力沒有明顯的影響。2.r CC16可以抑制由LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌的細胞炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6,高劑量下對IL-8有抑制作用,但對于IL-1β則沒有明顯的作用。3.(1)r CC16治療組與COPD組相比肺大泡的形成,氣道黏膜褶皺增多,纖毛脫落,管腔變窄等問題均有所改善,且高劑量較低劑量的作用明顯。(2)r CC16可以抑制肺泡灌洗液和血清中的TNF-α、IL-6及灌洗液中IL-8的表達,高劑量的r CC16可以抑制血清中IL-8的表達。提示r CC16具有抗炎作用。(3)r CC16治療組與COPD組相比,小鼠肺組織氣道上皮中的TIMP-1、MMP-9、ICAM-1的表達明顯減少,CC16的表達增多,NF-κB p65入核也有所減少。提示r CC16的抗炎作用可能依賴于NF-κB信號通路。
【關(guān)鍵詞】：Clara細胞 重組CC16蛋白質(zhì) 慢性阻塞性肺疾病 抗炎
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 常用縮寫詞中英文對照表17-18
• 前言18-21
• 第一部分 重組rCC16蛋白的誘導表達和純化21-35
• 1 材料與方法21-30
• 1.1 材料21-24
• 1.2 方法24-30
• 2 結(jié)果30-32
• 2.1 重組CC16蛋白的誘導表達30
• 2.2 重組融合蛋白His-rCC16的Western blotting鑒定30-31
• 2.3 重組CC16蛋白質(zhì)內(nèi)毒素的去除31
• 2.4 rCC16的活性檢測31-32
• 3 討論32-34
• 4 結(jié)論34-35
• 第二部分 重組rCC16抑制脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞炎癥介質(zhì)的表達35-45
• 1 材料與方法35-39
• 1.1 實驗材料35-36
• 1.2 實驗方法36-39
• 2 結(jié)果39-42
• 2.1 CCK-8 試劑盒檢測重組rCC16對RAW264.7 細胞的毒性作用研究39
• 2.2 不同劑量rCC16對LPS刺激RAW264.7 細胞IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 蛋白水平的影響39-42
• 3 討論42-44
• 4 結(jié)論44-45
• 第三部分 重組CC16蛋白質(zhì)對慢阻肺小鼠炎癥反應及炎癥介質(zhì)的表達作用的研究45-62
• 1 材料與方法45-49
• 1.1 材料45-46
• 1.2 方法46-49
• 2 結(jié)果49-58
• 2.1 COPD小鼠及rCC16干預后肺組織病理改變的HE染色49
• 2.2 COPD小鼠及rCC16干預后肺組織各相關(guān)蛋白的免疫組化結(jié)果49-55
• 2.3 各組小鼠血清和BALF中IL-6、IL-8、IL-1β 和TNF-α 炎癥表達水平檢測55-58
• 3 討論58-61
• 4 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-67
• 綜述67-79
• 參考文獻73-79
• 致謝79-81
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果81-82
• 個人簡歷82

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本文編號：456511