本文關(guān)鍵詞：dsODNs靶向封閉肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的抗炎作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:評(píng)估脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的雙鏈寡聚脫氧核苷酸(ds ODNs)競(jìng)爭(zhēng)性抑制對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)中核因子-κB(NF-κB)與DNA結(jié)合活性的影響效能,確定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染dsODNs的最適濃度及最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間,驗(yàn)證dsODNs-decoy策略靶向封閉肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的可行性,并探討其抗炎作用機(jī)制。方法:在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取出家兔的支氣管肺組織,用溫生理鹽水灌洗提取肺泡巨噬細(xì)胞,經(jīng)提純鑒定后,分對(duì)照組、LPS刺激組、Lipofectamine2000組和不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組,分別給予不同處理后培養(yǎng)。各組在培養(yǎng)4 h、6 h、8 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),用LDH試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量,了解不同處理對(duì)AMs的毒性損害;用共聚焦激光顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)及不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組AMs中熒光分布情況;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組中AMs的熒光強(qiáng)度及細(xì)胞攝取率確定最佳轉(zhuǎn)染條件;RT-PCR檢測(cè)dsODNs轉(zhuǎn)染后AMs中IL-1β、IL-6、TNF-α因子的mRNA表達(dá);Western-blot檢測(cè)ds ODNs-Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染后AMs內(nèi)NF-κB p65亞基在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的分布情況。結(jié)果:轉(zhuǎn)染AMs的dsODNs-Lipofectamine2000濃度比為1:5時(shí),LDH檢測(cè)細(xì)胞毒性適中,轉(zhuǎn)染效率最佳;從熒光強(qiáng)度、細(xì)胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率等方面綜合分析,轉(zhuǎn)染6 h為最佳時(shí)間;與LPS組比較,dsODNs-Lipofectamine2000組中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥介質(zhì)的mRNA表達(dá)均明顯被抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Western-blot結(jié)果顯示,經(jīng)ds ODNs-Lipofectamine2000處理后,AMs細(xì)胞質(zhì)中NF-κB p65亞基的表達(dá)明顯多于細(xì)胞核中。結(jié)論:dsODNs-Lipofecetamine2000能在體外有效轉(zhuǎn)染AMs,并成功抑制AMs中NF-κB相關(guān)炎性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá);結(jié)果顯示dsODNs-decoy策略可以抑制炎癥效應(yīng)細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路,用于臨床治療SIRS/ALI具有可行性。其作用機(jī)制除dsODNs可干擾NF-κB/DNA結(jié)合活性外,還可能通過抑制細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB與I-κB解離,從而抑制NF-κB活化,減少活化的NF-κB p65的入核,阻斷NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路。
【關(guān)鍵詞】：核因子-κB 雙鏈寡聚脫氧核苷酸 肺泡巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R56
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-14
• 文獻(xiàn)回顧14-25
• 1 實(shí)驗(yàn)材料25-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器25-26
• 1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑及配制26-29
• 2 實(shí)驗(yàn)方法29-38
• 2.1 支氣管肺泡灌洗法分離提取AMs29-30
• 2.2 AMs的鑒定與培養(yǎng)30-32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)分組32
• 2.4 LDH試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞毒性32-33
• 2.5 共聚焦激光顯微鏡觀察AMs攝取經(jīng)FITC標(biāo)記dsODNs后的熒光分布33
• 2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度和細(xì)胞攝取率33
• 2.7 RT-PCR檢測(cè)炎性介質(zhì)基因mRNA的表達(dá)33-35
• 2.8 Western-blot檢測(cè)AMs內(nèi)NF-κB p65蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的表達(dá)35-38
• 2.9 統(tǒng)計(jì)分析38
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-43
• 3.1 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間AMs培養(yǎng)液中LDH含量比較38-39
• 3.2 不同dsODNs-Lipofectamine2000比例AMs培養(yǎng)液中LDH含量比較39
• 3.3 AMs攝取經(jīng)FITC標(biāo)記dsODNs后的熒光分布比較39-41
• 3.4 不同比例dsODNs-Lipofectamine2000時(shí)轉(zhuǎn)染效率比較41-42
• 3.5 AMs中炎性介質(zhì)基因mRNA的表達(dá)比較42
• 3.6 AMs細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中NF-κB p65的表達(dá)比較42-43
• 4 討論43-48
• 小結(jié)48-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果56-57
• 致謝57

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本文編號(hào)：385839