本文關(guān)鍵詞：脂多糖對(duì)離體大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TMEM16A的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：急性肺損傷（acute lung injury，ALI)是指非心源性的各種肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭,急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratorydistress syndrome，ARDS）是急性肺損傷的嚴(yán)重階段，是一種常見(jiàn)危重癥，病死率極高。主要特征是肺泡毛細(xì)管膜損傷造成彌漫性肺損傷，導(dǎo)致肺泡與間質(zhì)內(nèi)聚積大量富蛋白的水腫液。臨床研究證實(shí)上皮細(xì)胞的損傷及肺泡液體清除力的下降是導(dǎo)致患者病死率升高的主要原因。因此減輕早期肺泡上皮損傷程度、提高肺泡液體清除力可有利于ARDS的治療。 肺泡液體清除是一項(xiàng)綜合功能，主要通過(guò)活性離子通道及完整上皮細(xì)胞的物理屏障維持相對(duì)干燥的肺泡環(huán)境。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolarepithelial cells typeⅡ，ATⅡ）在肺泡液體清除方面發(fā)揮重要作用。離子和水跨肺泡上皮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚未明確，，研究表明鈉離子通道(ENaC)、Na+-K+-ATP酶(NKA)、水通道(AQP)均參與肺泡液體清除并發(fā)揮重要作用。而氯離子通道對(duì)肺水清除的影響尚未完全清楚，已有研究證實(shí)囊性纖維化氣道跨膜調(diào)節(jié)子(cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)作為氯離子通道對(duì)肺泡液體清除發(fā)揮作用。2008年Schroeder等研究證實(shí)跨膜蛋白16A（TMEM16A）是鈣激活氯離子通道的分子基礎(chǔ)。有研究表明TMEM16A參與上皮細(xì)胞的分泌功能，Yang等利用免疫組化的方法確認(rèn)了TMEM16A在肺泡上皮細(xì)胞中有表達(dá)，但是有關(guān)TMEM16A對(duì)急性肺損傷時(shí)肺泡液體清除影響的研究甚少。 脂多糖（LPS）是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，LPS大量及持續(xù)釋放是引起ARDS發(fā)生、發(fā)展的重要因素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS對(duì)離體大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞造成急性肺損傷模型，有助于進(jìn)一步研究TMEM16A對(duì)急性肺損傷時(shí)肺泡液體清除的影響，本實(shí)驗(yàn)研究目的在于：1、分離、純化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞并進(jìn)行電鏡及染色鑒定。2、從炎癥因子的角度觀察LPS刺激體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞造成上清液中IL-8的變化。3、觀察不同時(shí)間及不同濃度LPS刺激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞引起的TMEM16A的mRNA的變化。 方法： 1選取清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體重為220±10g。按照Dobbs等提供的方法并適當(dāng)改進(jìn)分離大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AT Ⅱ)，用IgG免疫粘附的方法純化分離的細(xì)胞，①臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力及細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。②用電鏡及AKP染色的方法鑒定ATⅡ。③用AKP染色的方法測(cè)定ATⅡ純度。 2建立脂多糖對(duì)分離的ATⅡ損傷模型。ATⅡ分離、純化后培養(yǎng)24h，分三組：Ⅰ組(正常對(duì)照組)加入等容積培養(yǎng)基；Ⅱ組LPS終濃度1μg/ml；Ⅲ組LPS終濃度10μg/ml。分別測(cè)定刺激4h、8h后各組指標(biāo)的變化。①電鏡觀察比較各組ATⅡ超微結(jié)構(gòu)的變化。②用ELISA的方法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-8表達(dá)水平。③用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組TMEM16AmRNA表達(dá)水平的差異。 結(jié)果： 1ATⅡ計(jì)數(shù)，鑒定及活力測(cè)定：細(xì)胞純化后每只大鼠可得細(xì)胞（1.84±0.14）×107個(gè)，細(xì)胞活力為(93.69±1.16)％。AKP染色法檢測(cè)純化后細(xì)胞純度為（84.66±1.47）％。電鏡檢測(cè)可證實(shí)提取細(xì)胞為ATⅡ。 2透射電鏡檢測(cè)可證實(shí)ATⅡ急性損傷造模成功，可見(jiàn)細(xì)胞變性，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面微絨毛減少甚至消失，胞膜崩解，胞核固縮，胞質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞器明顯減少，板層小體出現(xiàn)排空及脫落，細(xì)胞空泡增多。 3用ELISA的方法檢測(cè)LPS損傷細(xì)胞的上清液中IL-8水平：體外培養(yǎng)的ATⅡ細(xì)胞經(jīng)LPS(1、10μg/ml)作用4h后IL-8水平與正常對(duì)照組相比顯著增強(qiáng),8h后差別依然存在。 4用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組肺泡II型上皮細(xì)胞上TMEM16AmRNA表達(dá)結(jié)果：LPS濃度為1μg/ml組：在LPS刺激4h后TMEM16A的mRNA水平與對(duì)照組無(wú)明顯變化（P＞0.05），在LPS刺激8h后TMEM16A的RNA水平與對(duì)照組有所增加（P＜0.05），LPS濃度為10μg/ml組在LPS刺激4h及8h后：TMEM16A的mRNA水平與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。 結(jié)論： 1本實(shí)驗(yàn)中原代大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞分離提純方法可以得到足夠純度和活力的細(xì)胞，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。脂多糖可以成功復(fù)制體外肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞急性損傷模型。 2脂多糖單獨(dú)作用于體外培養(yǎng)的ATⅡ可使細(xì)胞上清液中IL-8表達(dá)水平增加。 3LPS體外刺激ATⅡ使其TMEM16A的RNA表達(dá)增加，在一定時(shí)間及濃度內(nèi)，其表達(dá)量且隨LPS的濃度及刺激時(shí)間的增加而增加，TMEM16A作為氯離子通道可能參與了急性肺損傷時(shí)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
【關(guān)鍵詞】：TMEM16A 急性肺損傷 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞 脂多糖 白介素-8
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10
• 材料與方法10-20
• 結(jié)果20-21
• 附圖21-26
• 附表26-27
• 討論27-31
• 結(jié)論31
• 參考文獻(xiàn)31-34
• 綜述34-45
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 致謝45-46
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷46

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 曾慶富,蔣海鷹,錢仲,孫去病;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的分離純化及原代培養(yǎng)[J];中華病理學(xué)雜志;1998年05期

  本文關(guān)鍵詞：脂多糖對(duì)離體大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TMEM16A的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：365556