背景上皮鈉離子通道（epithelial sodium channel,ENaC）是具有阿米洛利敏感性、非電壓門控離子通道退化蛋白家族中的一個成員,由α、β、γ和δ四種亞單位組成的異源多聚體蛋白,其主要生理功能是跨越緊密相連的上皮單向地轉(zhuǎn)運Na⁺,調(diào)節(jié)水和離子的轉(zhuǎn)運。Ⅱ型肺泡上皮細胞是成年肺的干細胞,在肺損傷修復(fù)中起著重要作用,α-ENaC廣泛分布于Ⅱ型肺泡上皮細胞。研究表明,α-ENaC參與調(diào)節(jié)生物體的發(fā)育及疾病的發(fā)生,如細胞增殖、細胞分化以及肺水腫的發(fā)生等。但對α-ENaC在Ⅱ型肺泡上皮細胞的作用和功能及其分子機制仍不甚明了。目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合SSA-RPG陽性克隆篩選報告載體構(gòu)建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞系（L2細胞系）,檢測基因敲除后細胞增殖、遷移能力以及基因表達譜的變化,進而闡明α-ENaC在大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞系中的功能和作用。方法1.利用在線分析軟件（http://benchling.com）,設(shè)計合成3組靶向敲除α-ENaC基因第一外顯子的導(dǎo)向RNA,將3組片段分別克隆到CRISPR/Cas9表達載體骨架... 

【文章來源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

ENaC的定位和功能示意圖[33]

9和RuvC兩個功能域?qū)NA雙鏈進行切割。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)雖然大大提高了基因組編輯的效率，但是由于核酸酶工作效率的低下以及細胞自身修復(fù)能力的不足，導(dǎo)致大部分細胞在轉(zhuǎn)染核酸酶質(zhì)粒后，基因組DNA并未被切割[55]，或者靶位點發(fā)生了突變卻沒有可用于觀察和篩選的表型，所以我們聯(lián)合應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和SSA-RPG陽性細胞富集系統(tǒng)。SSA-RPG陽性細胞富集系統(tǒng)已廣泛運用于人、豬、小鼠和雞等多種細胞[56-60]，該系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合使用不僅能夠通過流式細胞術(shù)對陽性細胞進行富集，還能夠通過熒光顯微鏡觀察CRISPR/Cas9系統(tǒng)的核酸酶切割活性，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作效率大大提升。圖1-2CRISPR/cas9的切割域示意圖[61]Fig.1-2SchematicdiagramofthecleavagedomainsinCRISPR/cas9system[61]綜上所述，我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合SSA-RPG陽性細胞篩選系統(tǒng)構(gòu)建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞系，觀察基因敲除后細胞增殖能力、遷移能力以及基因表達譜的變化，進而闡明α-ENaC在大鼠L2細胞系中的功能和作用。

11MCO175三洋二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYON公司）HR40-ⅡA2生物安全柜（青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司）F01410.45μmPVDF膜（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）1×71倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）SpectraMaxParadigm酶標儀（美谷分子儀器有限公司）AVW-220D電子天平（上海精密科學(xué)儀器公司）Centrifuge5417R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）DYY-2C型電泳儀（北京六一科學(xué)儀器廠）ABISteponePlus實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）Tanon4500全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）THZ-D臺式恒溫振蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠）GeneGenius全自動凝膠成像系統(tǒng)（英國SYNGENE公司）2實驗方法2.1載體構(gòu)建2.1.1α-ENaC基因靶位點的選擇從NCBI獲取大鼠基因組α-ENaC基因的全長序列，利用在線分析軟件（http://benchling.com）針對α-ENaC基因的第一外顯子序列設(shè)計并篩選出3個得分較高的靶位點，如圖2-1所示。3個靶位點序列分別為GCATGGGCTGAGGAGGACAAGGG；CAACAACACCACCATCCACGGGG和TGTCCTCCTCAGCCCATGCAAGG，靶位點全長共23bp，其中劃線部分的20bp序列被稱為sgRNA，剩余3bp序列被稱為PAM（NGG）。圖2-1α-ENaC基因靶位點的選擇Fig.2-1Choiceofα-ENaCgenetargetsequence2.1.2α-ENaC/Cas9表達載體的構(gòu)建本實驗所用的Cas9表達載體骨架載體pll3.7-mU6-CMV-NLS-huCAS9-NLS來自西北農(nóng)林科技大學(xué)基因組學(xué)實驗室[62]，由mU6啟動子、sgRNA、CMV啟動子和人1.3主要儀器名稱品牌

【參考文獻】：
期刊論文
[1]急性呼吸窘迫綜合征小鼠肺內(nèi)源性干細胞表達水平的研究[J]. 劉姿,張文平.  中華細胞與干細胞雜志(電子版). 2019(04)
[2]骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基對小鼠肺泡上皮細胞增殖的影響及機制[J]. 周祉妤,昌建鈞,候亞鵬,丁炎,聶宏光.  山東醫(yī)藥. 2018(20)
[3]肺泡Ⅱ型上皮細胞在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中的研究進展[J]. 李百玲,柴家科,段紅杰,馬麗.  中華損傷與修復(fù)雜志(電子版). 2014(03)
[4]血清藥理學(xué)研究車前子對成骨細胞功能的影響[J]. 陳珺,劉家劍,盧麗,楊國柱,陸幸妍,黃劍,李青南.  中藥材. 2012(11)
[5]Ⅱ型肺泡上皮細胞與急性肺損傷的研究進展[J]. 李超然,王智剛,朱運奎.  中國醫(yī)藥科學(xué). 2011(11)
[6]上皮細胞鈉通道α亞基在大鼠和人睪丸、精子中的表達及其與精子活力的關(guān)系[J]. 孔祥斌,李紅鋼,熊承良.  中國計劃生育學(xué)雜志. 2007(03)

碩士論文
[1]急性肺損傷后內(nèi)源性肺干/祖細胞的動態(tài)變化及其修復(fù)作用[D]. 李海勝.第三軍醫(yī)大學(xué) 2013



本文編號：3520554