發(fā)布時(shí)間：2021-11-26 16:48

　　背景上皮鈉離子通道（epithelial sodium channel,ENaC）是具有阿米洛利敏感性、非電壓門控離子通道退化蛋白家族中的一個(gè)成員,由α、β、γ和δ四種亞單位組成的異源多聚體蛋白,其主要生理功能是跨越緊密相連的上皮單向地轉(zhuǎn)運(yùn)Na⁺,調(diào)節(jié)水和離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞是成年肺的干細(xì)胞,在肺損傷修復(fù)中起著重要作用,α-ENaC廣泛分布于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞。研究表明,α-ENaC參與調(diào)節(jié)生物體的發(fā)育及疾病的發(fā)生,如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及肺水腫的發(fā)生等。但對(duì)α-ENaC在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的作用和功能及其分子機(jī)制仍不甚明了。目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合SSA-RPG陽(yáng)性克隆篩選報(bào)告載體構(gòu)建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系（L2細(xì)胞系）,檢測(cè)基因敲除后細(xì)胞增殖、遷移能力以及基因表達(dá)譜的變化,進(jìn)而闡明α-ENaC在大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系中的功能和作用。方法1.利用在線分析軟件（http://benchling.com）,設(shè)計(jì)合成3組靶向敲除α-ENaC基因第一外顯子的導(dǎo)向RNA,將3組片段分別克隆到CRISPR/Cas9表達(dá)載體骨架... 

【文章來(lái)源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

ENaC的定位和功能示意圖[33]

9和RuvC兩個(gè)功能域?qū)NA雙鏈進(jìn)行切割。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)雖然大大提高了基因組編輯的效率，但是由于核酸酶工作效率的低下以及細(xì)胞自身修復(fù)能力的不足，導(dǎo)致大部分細(xì)胞在轉(zhuǎn)染核酸酶質(zhì)粒后，基因組DNA并未被切割[55]，或者靶位點(diǎn)發(fā)生了突變卻沒(méi)有可用于觀察和篩選的表型，所以我們聯(lián)合應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和SSA-RPG陽(yáng)性細(xì)胞富集系統(tǒng)。SSA-RPG陽(yáng)性細(xì)胞富集系統(tǒng)已廣泛運(yùn)用于人、豬、小鼠和雞等多種細(xì)胞[56-60]，該系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合使用不僅能夠通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行富集，還能夠通過(guò)熒光顯微鏡觀察CRISPR/Cas9系統(tǒng)的核酸酶切割活性，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作效率大大提升。圖1-2CRISPR/cas9的切割域示意圖[61]Fig.1-2SchematicdiagramofthecleavagedomainsinCRISPR/cas9system[61]綜上所述，我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合SSA-RPG陽(yáng)性細(xì)胞篩選系統(tǒng)構(gòu)建α-ENaC基因敲除的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系，觀察基因敲除后細(xì)胞增殖能力、遷移能力以及基因表達(dá)譜的變化，進(jìn)而闡明α-ENaC在大鼠L2細(xì)胞系中的功能和作用。

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【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]急性呼吸窘迫綜合征小鼠肺內(nèi)源性干細(xì)胞表達(dá)水平的研究[J]. 劉姿,張文平.  中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版). 2019(04)
[2]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)小鼠肺泡上皮細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制[J]. 周祉妤,昌建鈞,候亞鵬,丁炎,聶宏光.  山東醫(yī)藥. 2018(20)
[3]肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中的研究進(jìn)展[J]. 李百玲,柴家科,段紅杰,馬麗.  中華損傷與修復(fù)雜志(電子版). 2014(03)
[4]血清藥理學(xué)研究車前子對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響[J]. 陳珺,劉家劍,盧麗,楊國(guó)柱,陸幸妍,黃劍,李青南.  中藥材. 2012(11)
[5]Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞與急性肺損傷的研究進(jìn)展[J]. 李超然,王智剛,朱運(yùn)奎.  中國(guó)醫(yī)藥科學(xué). 2011(11)
[6]上皮細(xì)胞鈉通道α亞基在大鼠和人睪丸、精子中的表達(dá)及其與精子活力的關(guān)系[J]. 孔祥斌,李紅鋼,熊承良.  中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志. 2007(03)

碩士論文
[1]急性肺損傷后內(nèi)源性肺干/祖細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化及其修復(fù)作用[D]. 李海勝.第三軍醫(yī)大學(xué) 2013



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