脂多糖（LPS）,是革蘭氏陰性細(xì)菌外壁的主要成分,可致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征,目前尚無理想的抗內(nèi)毒素治療藥物。正常情況時人體內(nèi)LPS的水平很低,即使在革蘭陰性菌膿毒血癥時,血漿中LPS濃度僅為0.01¹ng/ml[1]。LPS發(fā)揮致炎作需要LBP/CD14的增敏效應(yīng)。脂多糖結(jié)合蛋白是脂多糖的結(jié)合蛋白,能將LPS單體轉(zhuǎn)運(yùn)至脂蛋白后通過肝臟從體內(nèi)清除,并可以將LPS遞呈給位于單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面的受體CD14,形成LPS/LBP/CD14三聯(lián)復(fù)合物,啟動LPS炎癥信號通路,誘發(fā)級聯(lián)炎癥效應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征。LPS/LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合是啟動LPS炎癥信號通路的關(guān)鍵點(diǎn),尋找LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點(diǎn)模擬肽,可以早期阻斷LPS炎癥信號通路。因此,本研究擬構(gòu)建LPS/LBP復(fù)合物,并以LPS/LBP復(fù)合物為底物進(jìn)行噬菌體十二肽庫篩選,獲得與LPS/LBP復(fù)合物具有較高親和力,并與CD14競爭結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物的噬菌體克隆。擬通過后續(xù)DNA測序后獲得LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點(diǎn)的模擬肽,為進(jìn)一步研究內(nèi)毒性急性呼... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

LPS/LBP復(fù)合物、LBP和LPS的凝膠顯像結(jié)果

圖 3-1 LPS/LBP 復(fù)合物凝膠電泳結(jié)果體親和篩選和篩選是用 LPS/LBP 復(fù)合物包被酶標(biāo)版，得到與 LPS/LBP 復(fù)合物高親。圖 3-2 顯示每輪藍(lán)斑測定滴度情況，表格二的顯示每輪的噬菌體的產(chǎn),得到與 LPS/LBP 高親和力的噬菌體克隆,后 2 輪采用 CD14 競爭性洗脫爭性結(jié)合 LPS/LBP 復(fù)合物的噬菌體克隆。比較 4 輪淘選的噬菌體回收率選所得的噬菌體回收率逐步提高。經(jīng) 4 輪篩選,回收率從 2.35x10-6增加菌體得到了有效的富集。表 2 各輪篩選的滴度測定及富集情況次數(shù) 篩選前滴度 (pfu) 篩選前滴度 (pfu) 回收率(%) 4.0x10109.40x1052.35x10-6

C D圖 3-2 每輪藍(lán)白斑測定滴度的拍照結(jié)果A: 1-R 的滴度檢測結(jié)果 B:2-R 的滴度檢測結(jié)果C:3-R 的滴度檢測結(jié)果 D:4-R 的滴度檢測結(jié)果3.2.3 ELISA 檢測結(jié)合活性第一次結(jié)合活性實(shí)驗：經(jīng)過四輪篩選后，ELISA 法檢測噬菌體克隆與 LPS/LBP 復(fù)合物的結(jié)合活性，隨機(jī)挑取 47 個單克隆，經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測，有 42 個單克隆發(fā)光檢測為陽性（陰性對照 OD 為 0.076），結(jié)果顯示 12 個噬菌體克隆所展示的多肽與 CD14 有較高親和力，OD450 高于對照組 2 倍以上，其中 6、9、13、16、23、25、29、37、43、46 這 10 個噬菌體克隆 OD450 高于對照組 3 倍以上，陰性對照未顯色。如表 3，表 4，圖 3-3-1。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3347537