脂多糖（LPS）,是革蘭氏陰性細(xì)菌外壁的主要成分,可致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征,目前尚無理想的抗內(nèi)毒素治療藥物。正常情況時(shí)人體內(nèi)LPS的水平很低,即使在革蘭陰性菌膿毒血癥時(shí),血漿中LPS濃度僅為0.01¹ng/ml[1]。LPS發(fā)揮致炎作需要LBP/CD14的增敏效應(yīng)。脂多糖結(jié)合蛋白是脂多糖的結(jié)合蛋白,能將LPS單體轉(zhuǎn)運(yùn)至脂蛋白后通過肝臟從體內(nèi)清除,并可以將LPS遞呈給位于單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面的受體CD14,形成LPS/LBP/CD14三聯(lián)復(fù)合物,啟動(dòng)LPS炎癥信號(hào)通路,誘發(fā)級(jí)聯(lián)炎癥效應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征。LPS/LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合是啟動(dòng)LPS炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵點(diǎn),尋找LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點(diǎn)模擬肽,可以早期阻斷LPS炎癥信號(hào)通路。因此,本研究擬構(gòu)建LPS/LBP復(fù)合物,并以LPS/LBP復(fù)合物為底物進(jìn)行噬菌體十二肽庫(kù)篩選,獲得與LPS/LBP復(fù)合物具有較高親和力,并與CD14競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物的噬菌體克隆。擬通過后續(xù)DNA測(cè)序后獲得LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點(diǎn)的模擬肽,為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)毒性急性呼... 

【文章來源】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：45 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

LPS/LBP復(fù)合物、LBP和LPS的凝膠顯像結(jié)果

圖 3-1 LPS/LBP 復(fù)合物凝膠電泳結(jié)果體親和篩選和篩選是用 LPS/LBP 復(fù)合物包被酶標(biāo)版，得到與 LPS/LBP 復(fù)合物高親。圖 3-2 顯示每輪藍(lán)斑測(cè)定滴度情況，表格二的顯示每輪的噬菌體的產(chǎn),得到與 LPS/LBP 高親和力的噬菌體克隆,后 2 輪采用 CD14 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫爭(zhēng)性結(jié)合 LPS/LBP 復(fù)合物的噬菌體克隆。比較 4 輪淘選的噬菌體回收率選所得的噬菌體回收率逐步提高。經(jīng) 4 輪篩選,回收率從 2.35x10-6增加菌體得到了有效的富集。表 2 各輪篩選的滴度測(cè)定及富集情況次數(shù) 篩選前滴度 (pfu) 篩選前滴度 (pfu) 回收率(%) 4.0x10109.40x1052.35x10-6

C D圖 3-2 每輪藍(lán)白斑測(cè)定滴度的拍照結(jié)果A: 1-R 的滴度檢測(cè)結(jié)果 B:2-R 的滴度檢測(cè)結(jié)果C:3-R 的滴度檢測(cè)結(jié)果 D:4-R 的滴度檢測(cè)結(jié)果3.2.3 ELISA 檢測(cè)結(jié)合活性第一次結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過四輪篩選后，ELISA 法檢測(cè)噬菌體克隆與 LPS/LBP 復(fù)合物的結(jié)合活性，隨機(jī)挑取 47 個(gè)單克隆，經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，有 42 個(gè)單克隆發(fā)光檢測(cè)為陽性（陰性對(duì)照 OD 為 0.076），結(jié)果顯示 12 個(gè)噬菌體克隆所展示的多肽與 CD14 有較高親和力，OD450 高于對(duì)照組 2 倍以上，其中 6、9、13、16、23、25、29、37、43、46 這 10 個(gè)噬菌體克隆 OD450 高于對(duì)照組 3 倍以上，陰性對(duì)照未顯色。如表 3，表 4，圖 3-3-1。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Phage display: development of nanocarriers for targeted drug delivery to the brain[J]. Babak Bakhshinejad,Marzieh Karimi,Mohammad Khalaj-Kondori.  Neural Regeneration Research. 2015(06)
[2]抗CD14單克隆抗體對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB（p65）影響的研究[J]. 侯林義,張紫琦,張繼峰,姜琴,呂潔萍,張文凱.  中華臨床醫(yī)師雜志(電子版). 2015(11)
[3]Bacteriophages and their applications in the diagnosis and treatment of hepatitis B virus infection[J]. Babak Bakhshinejad,Majid Sadeghizadeh.  World Journal of Gastroenterology. 2014(33)
[4]三條脂多糖結(jié)合蛋白/CD14結(jié)合位點(diǎn)模擬肽體外抗內(nèi)毒素活性的比較研究[J]. 徐智,李琦,馮起甲,錢桂生,徐順貴,李昆霖,王興勝,吳國(guó)明.  中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志. 2008(06)
[5]脂多糖結(jié)合蛋白與CD14結(jié)合位點(diǎn)模擬肽的初步篩選[J]. 馮起甲,徐智,吳國(guó)明,徐順貴,李樹鈞,陳維中,郭芮伶.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2007(16)
[6]脂多糖結(jié)合蛋白抗體對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺Ⅱ型細(xì)胞NF-κB活化的影響[J]. 李永旺,張德明,毛寶齡,錢桂生.  重慶醫(yī)學(xué). 2004(11)



本文編號(hào)：3347537