肺是人體的呼吸器官,位于胸腔,主要由上皮、支氣管、肺泡等組成,是實現(xiàn)機(jī)體與外界環(huán)境氣體交換,以維持人體生命活動的重要器官。肺發(fā)育異常會可導(dǎo)致多種嚴(yán)重的缺陷疾病,如先天性囊性肺疾病、肺發(fā)育不良或支氣管肺發(fā)育不良等,正常的肺發(fā)育過程對出生后的生存至關(guān)重要。在本課題中,主要探究Isl1是如何調(diào)控肺早期發(fā)育的分子機(jī)理,具體研究Isl1基因在肺上皮中的功能。我們利用Shh ^Cre小鼠與Isl1^flox/flox小鼠交配,獲得在肺上皮細(xì)胞中條件性敲除的突變體小鼠(Shh ^Cre;Isl1^flox/flox)。研究發(fā)現(xiàn),Isl1突變型小鼠出生致死,P0天HE染色結(jié)果顯示肺泡無張開。通過免疫組織學(xué)方法檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況發(fā)現(xiàn),Isl1突變型小鼠從E16.5天開始肺部細(xì)胞增殖異常升高,而細(xì)胞凋亡無差異。利用RNA-Seq測序篩選出Isl1可能的靶分子,并通過原位雜交實驗進(jìn)一步驗證差異表達(dá)基因,P0天突變型小鼠中AT2和AT1型上皮細(xì)胞標(biāo)記基因SLC34A2、SPC及AQP5表達(dá)顯著下降,Notch的配體Dlk1的表... 

【文章來源】：杭州師范大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

小鼠和人類肺部發(fā)育時間表[5]

d1(Dlk1)是Notch受體的非經(jīng)典配體。Dlk1是一種跨膜蛋白，隨著妊娠的進(jìn)行，Dlk1的表達(dá)會隨著細(xì)胞的分化而降低，在大多數(shù)組織中，出生后不存在Dlk1的表達(dá)[18]。成年人中，Dlk1僅在少數(shù)組織和祖細(xì)胞中表達(dá)，但在疾病和再生的過程中會重新表達(dá)[19]。Dlk1也是正常骨骼肌發(fā)育和再生所必需的[20]。研究表明，Dlk1對AT2-AT1的分化和肺泡修復(fù)至關(guān)重要，在肺損傷修復(fù)的過程中Notch信號在AT2上皮細(xì)胞中被激活，進(jìn)而刺激AT2細(xì)胞的增殖，但當(dāng)Dlk1表達(dá)到一定程度后會進(jìn)一步抑制Notch信號，從而促進(jìn)AT2上皮細(xì)胞向AT1上皮細(xì)胞的分化[21]。圖1-2小鼠肺發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞譜系[12]。（A），血管平滑肌（VSM），氣道平滑�。ˋSM），外周細(xì)胞（Pericytes）和近端血管內(nèi)皮細(xì)胞都來源于心肺祖細(xì)胞（CPP），而遠(yuǎn)端血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于VE-cadherin+祖細(xì)胞。（B），nkx2.1+內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)生sox2+近端祖細(xì)胞和sox9+/id2+遠(yuǎn)端祖細(xì)胞。近端祖細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)內(nèi)分泌（NE）細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞和粘膜細(xì)胞。遠(yuǎn)端祖細(xì)胞產(chǎn)生I型和II型肺泡上皮細(xì)胞

杭州師范大學(xué)碩士學(xué)位論文實驗內(nèi)容與設(shè)計52實驗內(nèi)容與設(shè)計2.1突變體小鼠的獲得為了研究Isl1在小鼠肺早期發(fā)育中的功能，我們利用條件性基因敲除技術(shù)（具體是Cre/Loxp的方法）來構(gòu)建小鼠肺上皮細(xì)胞特異性基因敲除小鼠進(jìn)行研究。實驗采取ShhCre小鼠與Isl1flox/flox小鼠交配，獲得在肺上皮細(xì)胞中特異性敲除Isl1基因的突變體小鼠（ShhCre;Isl1flox/flox）。圖2-1獲得突變體小鼠的繁殖圖2.2實驗內(nèi)容（1）獲得實驗突變小鼠、基因型鑒定、樣品和組織收集、處理樣品。（2）WholemountX-gal染色檢測ShhCre小鼠Cre酶活性及Isl1基因在早期胚胎小鼠肺部的表達(dá)特異性。（3）收集不同胚胎期和P0時期的實驗小鼠肺組織做HE染色實驗，觀察對照小鼠與Isl1敲除小鼠肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。（4）免疫組織化學(xué)方法檢測對照小鼠與突變體小鼠的肺部細(xì)胞增殖情況。（5）免疫組織化學(xué)方法檢測對照小鼠與突變體小鼠的肺部細(xì)胞凋亡情況。（6）利用RNA-Seq來篩選并分析出可能的存在的Isl1的靶分子。（7）采用原位雜交的方法來驗證存在差異的基因。


本文編號：3233884