本文關(guān)鍵詞：蛻皮甾酮對急性肺損傷大鼠肺組織中TNF-α mRNA及SP-A表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是指機(jī)體遭受嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、嚴(yán)重感染等打擊后,出現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞廣泛損傷為病理特征的一種失控炎癥反應(yīng)；是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的早期階段,臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性肺部彌漫性滲出致呼吸困難及難以糾正的低氧血癥。目前ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,尚未完全闡明,但經(jīng)過大量基礎(chǔ)研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等改變均參與疾病發(fā)展,其中炎癥與抗炎癥反應(yīng)之間平衡與失衡在發(fā)病過程中起重要作用。目前,普遍認(rèn)為ALI發(fā)病機(jī)制是在致病因子作用下激活中性粒細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞,并釋放大量炎性介質(zhì)造成機(jī)體的損傷,同時這些炎性因子能作用其他炎性細(xì)胞來釋放更多的炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子,使機(jī)體損害信號進(jìn)一步放大,形成炎癥瀑布效應(yīng),引起的過度或失控性的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)。 在臨床上,急性肺損傷的主要原因是細(xì)菌感染后釋放內(nèi)毒素引起的,致病主要成分是細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。LPS與相應(yīng)受體結(jié)合后,啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子TNF-α等釋放。這些炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用,造成肺泡細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞損傷,血管通透性增加,導(dǎo)致肺水腫,引起肺表面活性物質(zhì)分泌減少,肺泡上皮屏障破壞。所以,本實(shí)驗(yàn)通過大鼠腹腔注射LPS復(fù)制ALI模型,并給予特定藥物治療,來觀察炎性介質(zhì)及抗炎物質(zhì)水平的動態(tài)變化。 腫瘤壞死因子α (Tumor Necrosis Factor α, TNF-α)在炎癥中是一具始動和關(guān)鍵性作用的促炎免疫分子,主要由激活的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞分泌,是具有多種功能的多肽。目前已知TNF-a與相應(yīng)受體結(jié)合后,刺激炎性細(xì)胞粘附并釋放氧自由基等大量炎性介質(zhì)來發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；刺激單核巨噬細(xì)胞增加IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等炎性因子的產(chǎn)生,進(jìn)一步加重組織損傷。因此,TNF-α是觀察ALI程度較好指標(biāo)。 表面活性蛋白(Surfactant Protein,SP)是主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管非纖毛上皮細(xì)胞分泌的一類特異性脂蛋白復(fù)合物。SP含量中最豐富且生物活性最強(qiáng)的蛋白是肺表面活性蛋白A (Surfactant Protern A,SP-A).研究表明,它能維持肺泡的正常結(jié)構(gòu)和功能；調(diào)節(jié)肺內(nèi)免疫和炎癥反應(yīng)；參與調(diào)節(jié)肺表面活性物質(zhì)的合成、代謝；通過特異性與微生物和微粒子結(jié)合,增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力,并抑制多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的合成與釋放。目前認(rèn)為,SP-A在ALI患者中存在內(nèi)源性代謝異常而減少,加重急性肺損傷。 迄今,ALI/ARDS的藥物治療已成為臨床研究的一個熱點(diǎn),但仍未找到切實(shí)可靠的治療性藥物,所以尋找其保護(hù)性藥物十分必要。蛻皮甾酮(Ecdysterone, EDS)是一種廣泛存在自然界的甾體化合物,屬于昆蟲生長代謝調(diào)節(jié)激素,最早為昆蟲學(xué)家研究�，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)EDS在植物界也廣泛存在且同樣在高等動物表現(xiàn)出較強(qiáng)的生理活性：能促進(jìn)核酸及蛋白質(zhì)的合成、抗氧化、促進(jìn)缺血區(qū)血管的生成和側(cè)支循環(huán)的建立,還能有效促進(jìn)傷口愈合等。 近年來研究表明EDS還能改善肺組織水腫、降低肺血管通透性等作用,提示對ALI可能具有一定治療作用。為了進(jìn)一步探討EDS對ALI治療作用機(jī)理,我們通過脂多糖誘導(dǎo)ALI大鼠模型,觀察EDS對ALI大鼠的肺組織中炎性介質(zhì)TNF-α及SP-A的水平變化,以闡明EDS對ALI的治療作用效果及可能的機(jī)制。 目的 觀察不同劑量EDS對ALI大鼠肺組織中TNF-α mRNA及SP-A的表達(dá)的影響及其相關(guān)性；探討蛻皮甾酮(EDS)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷(ALI)的保護(hù)機(jī)理。 方法 1.實(shí)驗(yàn)動物模型制作與分組方法：通過Wister大鼠腹腔注射LPS建立急性肺損傷模型。120只健康SPF級成年雄性Wister大鼠,體重170-220克,隨機(jī)分為模型組(24只,L組)、空白對照組(24只,N組)、治療組(即不同劑量蛻皮甾酮組,T組)[分3個亞組：LPS+EDS20mg/kg組(T1組,24只)、LPS+EDS30mg/kg組(T2組,24只)、LPS+EDS40mg/kg組(T3組,24只)],各組根據(jù)注射脂多糖后觀察時間不同再分為2h、4h、24h共3個亞組,每組8只。模型組和治療大鼠均經(jīng)腹腔注射脂多糖8mg/kg復(fù)制急性肺損傷模型,對照組腹腔注射等體積生理鹽水。蛻皮甾酮不同劑量治療組在建模1h后給予相應(yīng)劑量的蛻皮甾酮溶液尾靜脈注射；對照組及模型組給予相應(yīng)等體積生理鹽水。 2.標(biāo)本采集檢測方法：分別于相應(yīng)時間用3%戊巴比妥鈉(30m/kg)腹腔麻醉各組后,腹主動脈放血處死動物�？焖偌糸_胸腔,取出雙側(cè)肺臟。取各組大鼠右肺下葉HE染色觀察病理改變,并根據(jù)病理學(xué)改變進(jìn)行相應(yīng)評分；取右上肺葉,計(jì)算各組肺濕重與肺干重比值(W/D)；并使用實(shí)時熒光定量PCR即(Real-time PCR, RT-PCR)法檢測左肺組織勻漿TNF-α mRNA的表達(dá)；使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定左肺組織勻漿中TNF-α;采用Western Blot方法檢測SP-A的表達(dá)水平。 結(jié)果 1.一般狀態(tài)觀察：N組的大鼠呼吸平穩(wěn),未見紫紺,活動基本正常,反應(yīng)靈敏；L組的大鼠在注射LPS后呼吸明顯加快,活動不活躍,抓取時無力逃避,以4h最為明顯并伴有紫紺；T組的大鼠呼吸急促程度較LPS組有所減輕,個別大鼠出現(xiàn)輕微紫紺,但較LPS組活潑,抓取時能夠逃避。其中2h時,T組的狀況相似,但在4h、24h時T3組較T1、T2組大鼠的狀況較好。 2.光鏡下觀察：200倍光鏡下觀察大鼠右下肺組織HE染色結(jié)果顯示：N組大鼠肺組織的結(jié)構(gòu)物完整,肺泡間隔無水腫,肺泡腔清晰,肺泡間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤；L組肺泡壁破壞,腔內(nèi)出血,肺間質(zhì)充血水腫,有大量炎性細(xì)胞浸潤；提示肺損傷模型成功。不同劑量T組的肺組織中相對于L組上述改變均有所減輕,程度隨劑量增加而減輕。肺損傷的病理學(xué)評分依據(jù)肺泡和間質(zhì)炎癥及出血、肺水腫、肺不張和透明膜形成；經(jīng)評分后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組間病理改變程度為LT1T2T3N;時間趨勢為：各組肺損傷程度評分在時間上以4h為重,24h次之,2h較輕。 3.肺干重／濕重(W/D)：與N組相比,L組及T組在2h,4h,24h各時間點(diǎn)W/D顯著升高(P0.05),其中4h為高峰,24h次之,2h最低。與L組相比,T組各亞組在4h,24h時間點(diǎn)W/D均顯著降低(P0.05),但在2h里,L組與T1、T2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而T3明顯降低(P0.05)。同一組內(nèi)在不同時間上W/D的趨勢為：4h24h2h。 4.肺組織中TNF-α含量：N組TNF-α在各時相點(diǎn)表達(dá)均非常微弱,且相互之間無明顯差別。其余各組與N組相比,表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P0.05)。與LPS組比較,T組各亞組間在2h、4h、24h均可顯著降低肺組織TNF-α的含量(P0.05)。亞組之間比較：T3組在4h、24h時間點(diǎn)TNF-α的表達(dá)呈現(xiàn)T3T2、T1(P0.05),但在2h時與T2無明顯差異；T2在2h、4h時間點(diǎn)TNF-α的表達(dá)顯著低于T1(P0.05),兩者在24h無明顯差異。在時間表達(dá)上,L組及各T亞組的組內(nèi)在三個時間點(diǎn)的肺組織TNF-α的含量兩兩相比均有顯著差異(P0.05),呈現(xiàn)4h2h24h(P0.05)。 5.肺組織中TNF-α mRNA含量：實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：N組TNF-α mRNA在各時相點(diǎn)的表達(dá)均非常微弱,且相互之間無明顯差別。其余各組與N組相比,表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P0.05)。與LPS組比較,T組在不同時間點(diǎn)均可顯著降低肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)(P0.05)。T組亞組之間在2h、4h、24h時間點(diǎn)TNF-α mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)T3T2T1(P0.05)。時間表達(dá)趨勢為4小時最高,2小時次之,24小時最低,即4h2h24h(P0.05)。 6.肺組織中SP-A含量：在2h、4h、24h里,N組大鼠肺組織中SP-A表達(dá)無明顯差異,但均明顯高于比T組和L組(P0.05)；T組各亞組之間在不同時間點(diǎn)的SP-A表達(dá)都高于L組,且有顯著性差異(P0.05)；T組亞組之間在24h時間點(diǎn)的肺組織SP-A表達(dá)隨劑量增加而逐漸上升,即T3T2T1(P0.05),在2h時,呈現(xiàn)T3T2、T1(P0.05),但T2、T1在此時間點(diǎn)相比無顯著差異(P0.05)。在4h時,呈現(xiàn)T3、T2T1(P0.05),但T2、T3在此時間點(diǎn)相比無顯著差異(P0.05)。時間表達(dá)趨勢為4小時最低,24小時次之,2小時最高(P0.05)。 結(jié)論 1.通過腹腔注射LPS可以成功復(fù)制ALI大鼠模型。 2.LPS注射后導(dǎo)致大鼠肺組織水腫；光鏡下肺損傷嚴(yán)重；促炎細(xì)胞因子TNF-α mRNA表達(dá)增強(qiáng)；肺保護(hù)物質(zhì)SP-A含量下降。并在注射LPS4小時后,肺損傷程度最重,2h次之,24h時損傷有所減輕。 3.蛻皮甾酮(EDS)對ALI具有保護(hù)作用,其效應(yīng)具有濃度依賴性。其機(jī)制可能與抑制肺組織中TNF-α mRNA的表達(dá),并促進(jìn)SP-A合成及釋放有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 蛻皮甾酮 脂多糖 腫瘤壞死因子-α 表面活性蛋白A
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563.8
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-22
• 材料與方法22-32
• 1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-44
• 1 大鼠一般狀態(tài)觀察32
• 2 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化32-36
• 3 大鼠肺組織濕重/干重(W/D)變化36-38
• 4 肺組織勻漿中ELISA法測TNF-α表達(dá)結(jié)果38-40
• 5 實(shí)驗(yàn)各組肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)變化比較40-41
• 6 實(shí)驗(yàn)各組肺組織SP-A的表達(dá)變化比較41-44
• 討論44-54
• 1 LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷動物模型的評價44-47
• 2 細(xì)胞因子TNF-α及SP-A在急性肺損傷中的作用47-51
• 3 蛻皮甾酮對肺損傷保護(hù)作用51-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 符號說明60-62
• 綜述62-72
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 成果72-73
• 致謝73-74

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10 劉霞;活化NF-κ Bp65mRNA、IL-1βmRNA、IL-4mRNA在MsPGN中檢測及其意義[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2003年

  本文關(guān)鍵詞：蛻皮甾酮對急性肺損傷大鼠肺組織中TNF-α mRNA及SP-A表達(dá)的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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