【研究背景】支氣管哮喘（哮喘）是一個嚴(yán)重危害人類健康的疾病，目前尚缺少有效的防治方法。哮喘的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種效應(yīng)細(xì)胞及其分泌的炎癥介質(zhì)。氣道上皮細(xì)胞就是其中具有重要作用的效應(yīng)細(xì)胞之一，它位于外界刺激與機體內(nèi)環(huán)境接觸的第一環(huán)節(jié)，在哮喘中處于持續(xù)損傷與異常修復(fù)的狀態(tài)，能夠分泌多種炎癥介質(zhì)，影響周圍組織及炎性細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，被認(rèn)為是哮喘發(fā)生的始動部位之一。近年的研究表明，上皮中杯狀細(xì)胞特有的一種鈣激活Cl^-通道（CLCA）是上皮杯狀細(xì)胞參與哮喘發(fā)生的主要功能單位，阻斷CLCA是防治哮喘具有潛在前景的措施。這種功能獨特的CLCA已知基因序列有：人hCLCA1、小鼠mCLCA3。以CLCA為作用靶位的哮喘防治疫苗尚無研究。 【目的】1、利用hCLCA1和mCLCA3的異種同源性，構(gòu)建人源hCLCA1 DNA疫苗，肌注法接種給小鼠，試圖突破小鼠自我的免疫耐受屏障，誘導(dǎo)其產(chǎn)生針對自身mCLCA3胞外肽段的交叉抗體，以期達到阻斷氣道m(xù)CLCA3通透活性、防治哮喘發(fā)生的目的。2、利用小鼠在體哮喘模型、杯狀細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞模型，初步探討該疫苗防治哮喘效應(yīng)的機制。 ... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

hCLCAI基因的部分測廳結(jié)果

圖1.3mcLcA3部分測序結(jié)果F191.3PartofthesequeneingresultofhCLCAIgene1.2.2DNA疫苗的合成由于載體psecTagZ一B中沒有Nhol酶切位點，故首先采用PCR法重新設(shè)計hCLCAIcDNA酶切位點。考慮到質(zhì)粒模板擴增效率高，在上游引物3’端完全互補的同時，將5’端改為Hindm序列。PCR結(jié)果可見2.7kb左右有特異條帶。測序鑒定正確后，將該cDNA與psecTagZ一B均采用Hindlll、Xhol酶切并連接。psecTagZ一B爪CLCAI的雙酶切鑒定證實該質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1.4)。1.2.3mCLCA3胞外膚段的克隆、表達與純化(l)克隆:N一ED、M一ED和C一ED三個胞外膚段的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，分別在59lbp、186bp、687bp處出現(xiàn)預(yù)期條帶(圖

經(jīng)BamHI和Ec口Rl雙酶切后，與分別同樣酶切的載體連接，重圖1，4圖1.4pseeTagZ一B小CLcAI重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果F191.4IdentifieationofreeombinentPlasmidsofPSee幾92一BM:DNAmaker:l:DigestedPSeeTagZ一B/hCLCAI圖1.5mCLCA3三個胞外段基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析F191.5AnalysisofPCRProduetofthreeextraeellulardomainsofmCLCA3byagarosegeleleetroPhoresisM:DL2000DNAmarker:l:N一EDgene:2:M一EDgene:3:C一EDgene構(gòu)pRsET-A月呵一ED、pGEX一2不l服一ED和pRsE下刀e一En原核表達質(zhì)粒，酶切鑒定正確(圖1.6)。由于M一ED分子量過小，為方便鑒定與純化，故選擇與GST融合表達的方式。圖1.6mCLCA3三個胞外膚段原核表達質(zhì)粒的酶切鑒定Fig1.6IndentifieationofexPressionPlasmidsofthreeextracellulardomainsofmCLCA3A:PRSET-A/N一ED;B:PGEX一2T-1/M一ED:C:PRSET-A/C一ED(2)表達:三種重組質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化丑eoliBL21(nE3)和IPTG誘導(dǎo)表達，SDS一PAGE檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)化空載體的相應(yīng)對照組相比，在Mrx103為25.21、33.94和29.31處分別出現(xiàn)濃重條帶(圖1.7)，分別與6His一N一ED、GST-M一ED和6His一C一ED對應(yīng)。49

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2999124