一、IPF和非IPF患者肺成纖維細(xì)胞表面Thy-1的表達(dá)及在TGF-β刺激下的表達(dá)差異 目的:建立肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法,為肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療措施體外研究提供細(xì)胞技術(shù)平臺(tái);探索IPF和非IPF患者肺成纖維細(xì)胞株的亞群差異。 方法:采用肺組織塊接種培養(yǎng)法,培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)相差顯微鏡和透射電鏡觀察形態(tài)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)記蛋白等進(jìn)行鑒定,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各種情況下表面Thy-1的陽(yáng)性率,并用流式分選系統(tǒng)(FACS)分選出Thy-1(-)細(xì)胞。 結(jié)果:培養(yǎng)的IPF患者成纖維細(xì)胞株細(xì)胞呈梭形,單個(gè)核,多突起,有偽足,邊緣清晰整齊,貼壁生長(zhǎng),表達(dá)波形蛋白(vimentin)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),不表達(dá)角蛋白(cytokeratin)和結(jié)蛋白(desmin)。電鏡觀察到胞質(zhì)中有絲狀a-SMA纖維。IPF成纖維細(xì)胞株的表面抗原Thy-1陽(yáng)性率明顯低于正常成纖維細(xì)胞株,并分成明顯的Thy-1陽(yáng)性和陰性兩個(gè)亞群。TGF-β刺激后IPF成纖維細(xì)胞株的Thy-1的陽(yáng)性率降低比正常細(xì)胞株明顯。 結(jié)論:原代培養(yǎng)的IPF患者成纖維細(xì)胞株細(xì)胞含有肌成纖維細(xì)胞(MyoF)并且可以傳代,可分選出Thy(-)細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。成纖維細(xì)胞表面抗原Thy-1的陽(yáng)性率在纖維化肺組織和正常肺組織是有顯著差異的,經(jīng)TGF-β刺激后其差異更加明顯。 二、表觀遺傳藥物5-氮雜胞苷、丙戊酸鈉對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖及分化的影響 目的:探索表觀遺傳藥物對(duì)IPF患者肺成纖維細(xì)胞株的干預(yù)影響,以期為肺纖維化的治療提供一個(gè)新的選擇。 方法:用DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷和組蛋白乙�；敢种苿┍焖徕c處理IPF患者肺成纖維細(xì)胞株,地塞米松為對(duì)照。用噻唑蘭MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)細(xì)胞株的增殖和藥物的細(xì)胞毒性情況。分別應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察各藥刺激前后該細(xì)胞株表面Thy-1表達(dá)的變化和細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)差異。 結(jié)果:IPF患者肺成纖維細(xì)胞株在DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷處理24小時(shí)后可明顯抑制增殖,5μmol/l作用48小時(shí)后表面抗原Thy-1的陽(yáng)性率上升為93.7%±1.95%,5μmol/l處理5天后α-SMA的陽(yáng)性率下降為49.2%±6.4%(p＜0.05)。在丙戊酸鈉處理24小時(shí)后顯著抑制增殖,10 mg/ml作用48小時(shí)后表面抗原Thy-1的陽(yáng)性率上升為95.5%±2.21%,10 mg/ml處理5天后α-SMA的陽(yáng)性率下降為36.6%±6.9%(p＜0.05)。地塞米松雖然可明顯抑制IPF患者肺成纖維細(xì)胞株的增殖,5μmol/l劑量作用24小時(shí)后表面抗原Thy-1的陽(yáng)性率上升為87.7%±1.46%,但在5μmol/l劑量作用5天后α-SMA的陽(yáng)性率為86.3%±4.9%(p＞0.05)。 結(jié)論:表觀遺傳藥物DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷和組蛋白乙�；敢种苿┍焖徕c能夠抑制IPF患者肺成纖維細(xì)胞株的增殖,在相應(yīng)的亞細(xì)胞毒性劑量上可導(dǎo)致細(xì)胞表面抗原Thy-1的表觀上調(diào),使肌成纖維細(xì)胞的特征標(biāo)記物平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA表達(dá)降低。在肺纖維化的治療中具有應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R563
【文章目錄】：
目錄
縮略語(yǔ)
實(shí)驗(yàn)流程圖
中文摘要
Abstract
第一部分 IPF和非IPF患者肺成纖維細(xì)胞表面Thy-1的表達(dá)及在TGF-β刺激下的表達(dá)差異
    前言
    實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料
        一、肺組織來(lái)源
        二、細(xì)胞因子TGF-β
        三、主要耗材
        四、主要試劑
        五、主要儀器
    實(shí)驗(yàn)方法
        一、人肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)
        二、成纖維細(xì)胞的鑒定
        三、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）
        四、流式分選術(shù)（FACS）
    結(jié)果
        一、成纖維細(xì)胞的鑒定
        二、IPF和非IPF患者肺成纖維細(xì)胞表面Thy-1的表達(dá)和在TGF-β刺激下表面Thy-1的表達(dá)差異
        三、IPF患者肺成纖維細(xì)胞分選
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第二部分 表觀遺傳藥物5-氮雜胞苷、丙戊酸鈉對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖及分化的影響
    前言
    實(shí)驗(yàn)材料
        一、細(xì)胞來(lái)源及細(xì)胞培養(yǎng)
        二、表觀遺傳藥物5-氮雜胞苷、丙戊酸鈉以及地塞米松
        三、主要耗材
        四、主要試劑及試劑盒
        五、主要儀器
    實(shí)驗(yàn)方法
        一、細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTT試驗(yàn)）
        二、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）
        三、免疫細(xì)胞化學(xué)法
        四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    結(jié)果
        一、表觀遺傳藥物和激素刺激前后IPF患者肺成纖維細(xì)胞株的增殖情況
        二、表觀遺傳藥物和激素刺激前后IPF患者肺成纖維細(xì)胞株表面Thy-1的表達(dá)差異
        三、表觀遺傳藥物和激素刺激前后IPF患者肺成纖維細(xì)胞株α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)差異
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
綜述 Thy-1——影響肺纖維化發(fā)展的成纖維細(xì)胞亞群的特征標(biāo)記分子
附錄 主要溶液的配制
致謝

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2863301