急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由多種致病因素引起的肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞受損,引起炎癥細胞浸潤,血漿蛋白滲出,肺間質和肺泡水腫,從而導致急性呼吸功能不全。病理生理表現(xiàn)為肺順應性降低、通氣/血流比例失調。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)為ARDS發(fā)病的病理損傷機制。ARDS發(fā)病率和死亡率都很高,目前臨床上治療措施除了控制原發(fā)病、呼吸支持、控制感染、加強護理外,無特效治療藥物。因此,有必要對ARDS機制進一步研究并尋找更為安全有效的治療藥物。胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)是腸道L細胞分泌的肽類激素。GLP-1受體(glucagon like peptide-1 receptor,GLP-1R)為GLP-1天然的靶點,分布于各個組織臟器,具有廣泛的生物學作用。利拉魯肽為GLP-1類似物,臨床上常用于2型糖尿病的治療,可以結合并激活GLP-1R。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1R激活可以保護內皮細胞屏障功能、調節(jié)炎癥反應,從而保護多個器官免受多種損傷因素導致的功能損害�？紤]到GLP-1R的抗炎和內皮保護作用,激活GLP-1R可能有利于ARDS的治療。因此,本研究第一部分,小鼠氣道內滴注脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)建立ALI模型,研究利拉魯肽激活GLP-1R對小鼠ALI的保護作用及相關機制。第二部分,將中性粒細胞和人肺微血管內皮細胞共培養(yǎng),進一步探索利拉魯肽激活GLP-1R對LPS誘導的人肺微血管內皮細胞功能的影響及其相關機制。第一部分GLP-1受體激活對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷保護作用目的:觀察利拉魯肽激活GLP-1R對LPS誘導的小鼠ALI保護作用及其機制。方法:40只C57BL/6小鼠隨機分為5組:對照組、LPS組、LPS+利拉魯肽(0.2、0.8 mg/kg)組、利拉魯肽(0.8 mg/kg)單獨給藥組,每組8只。氣道滴注LPS(15 mg/kg)建立小鼠ALI模型,并同時皮下注射利拉魯肽。24小時后處死小鼠,收集外周血、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、肺組織。ELISA檢測血清和BALF GLP-1含量,RT-qPCR檢測肺組織GLP-1R、TLR4及MIF、IL-6、CXCL1、CXCL2 mRNA水平,Western blot檢測GLP-1、TLR4及細胞間連接蛋白ZO-1、Occludin、VE-cadherin表達;HE染色和定量肺損傷評分評估肺組織病理損傷;免疫組化染色評估肺組織中性粒細胞浸潤;細胞分類計數(shù)計算BALF內中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量;TUNEL檢測細胞凋亡;伊文斯蘭染料滲出實驗和BALF蛋白含量測定評估肺血管通透性。結果:HE染色顯示,LPS誘導小鼠肺泡彌漫性損傷,利拉魯肽(0.2、0.8mg/kg)減輕LPS誘導肺部病理損傷程度。免疫組化顯示,ALI小鼠肺組織大量Ly6G~+中性粒細胞浸潤,利拉魯肽(0.2、0.8mg/Kg)給藥顯著減少中性粒細胞浸潤。BALF中細胞分類計數(shù)結果顯示,利拉魯肽(0.8mg/Kg)抑制LPS誘導的肺泡間隙中性粒細胞、巨噬細胞滲出。RT-qPCR結果顯示,利拉魯肽(0.2、0.8mg/kg)降低LPS誘導的炎癥因子MIF、IL-6、CXCL1、CXCL2的mRNA表達。與對照組相比,LPS組小鼠伊文斯蘭染料和蛋白滲出明顯增多,利拉魯肽(0.2、0.8mg/kg)顯著減少其滲出。TUNEL染色結果顯示,LPS誘導小鼠肺部凋亡細胞數(shù)量增多,利拉魯肽(0.2、0.8mg/kg)給藥顯著減少LPS誘導的細胞凋亡。與對照組相比,LPS可使小鼠血清GLP-1水平降低,而BALF中GLP-1水平升高,肺組織GLP-1R、TLR-4 mRNA和GLP-1、TLR-4蛋白也因LPS刺激表達增加,利拉魯肽抑制上述效應。Western blot結果顯示,LPS刺激降低肺組織中VE-cadherin、ZO-1和Occludin蛋白表達,利拉魯肽(0.8 mg/kg)給藥恢復這些蛋白的表達。結論:激活GLP-1R,利拉魯肽緩解LPS誘導的小鼠肺部病理損傷、減少炎癥細胞浸潤和相關炎癥因子釋放、降低肺毛細血管通透性、維持肺血管內皮屏障功能,從而減輕LPS誘導的小鼠ALI。第二部分GLP-1受體激活對人肺微血管內皮細胞功能的影響及其機制目的:探討利拉魯肽激活GLP-1R對培養(yǎng)的人肺微血管內皮細胞功能的影響及其機制。方法:培養(yǎng)人肺微血管內皮細胞,分為Control組、LPS組、LPS+利拉魯肽(200、400、800nM)組、利拉魯肽(800nM)單獨給藥組;RT-qPCR檢測ZO-1、Occludin mRNA水平。免疫熒光和Western blot檢測ZO-1、VE-cadherin表達。將中性粒細胞和經(jīng)LPS刺激的人肺微血管內皮細胞共培養(yǎng),RT-qPCR和Western blot檢測細胞間粘附分子-1(cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1 adhesion molecule-1,VCAM-1)表達;免疫熒光法檢測人肺微血管內皮細胞上中性粒細胞粘附情況。Transwell分析中性粒細胞跨內皮遷移。Western blot檢測Rho-GTP蛋白和MYPT1、p65磷酸化水平。結果:利拉魯肽抑制LPS誘導的人肺微血管內皮細胞ZO-1,Occludin mRNA和ZO-1、VE-cadherin蛋白表達的下調。免疫熒光染色結果顯示,利拉魯肽恢復細胞間連接VE-cadherin和ZO-1表達。共培養(yǎng)研究結果顯示,利拉魯肽抑制LPS誘導的人肺微血管內皮細胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1 mRNA及其蛋白表達,減少中性粒細胞向活化的人肺微血管內皮細胞粘附和跨內皮遷移;利拉魯肽抑制LPS誘導的人肺微血管內皮細胞胞內Rho-GTP和磷酸化的MYPT1、p65蛋白表達。結論:GLP-1R激活有利于維持人肺微血管內皮細胞間連接,抑制人肺微血管內皮細胞黏附分子表達,減輕LPS誘導的人肺微血管內皮屏障功能障礙,減少中性粒細胞向內皮細胞粘附和跨內皮遷移。GLP-1R激活能夠通過抑制Rho和NF-κB信號通路,從而減輕LPS誘導的人肺微血管內皮細胞功能障礙。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

圖 1. GLP1-R 激活對 ALI 小鼠肺組織病理損傷影響。HE 染色觀察肺組織損傷，定量肺損傷評分量化肺組織損傷情況。*P＜0.05。二、GLP-1R 激活對 ALI 小鼠肺部炎癥細胞浸潤的影響

圖 2. GLP-1R 激活對 ALI 小鼠肺部炎癥反應的影響。（A）免疫組化檢測肺組織中性粒細胞浸潤；（B）BALF 內中性粒細胞分類計數(shù)；（C）BALF內巨噬細胞分類計數(shù)；*P＜0.05 vs control，#P＜0.05 vs LPS 組。

GLP-1R 激活對 ALI 小鼠肺部炎癥因子表達的影響。鼠肺組織中炎癥因子，包括 MIF、IL-6、CXCL1、CXCL2 的表達。*P＜0.05GLP-1R 激活對 ALI 小鼠肺血管通透性的影響如圖 4A 所示，與對照組相比，LPS 組肺組織明顯變藍，提示從血管
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本文編號：2850780