發(fā)布時間：2020-10-13 14:42

　　 背景:肺纖維化是一種嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)破壞性肺間質(zhì)疾病,其特點為早期肺上皮細(xì)胞炎癥,隨著病程進展,肺成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞過度活化,所產(chǎn)生的大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積在肺間質(zhì),從而破壞正常的肺部結(jié)構(gòu)。雖然其致病原因不明且治療手段較少,但已有證據(jù)表明,基因?qū)W和表觀遺傳學(xué)改變,比如DNA甲基化,在其中起著至關(guān)重要的作用。已有的大量研究表明,肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。最近的一些研究證實,CDKN2B基因在肺纖維化病人肺成纖維細(xì)胞中存在差異甲基化狀態(tài),但其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機制,目前尚沒有相關(guān)報道。目的:通過構(gòu)建肺纖維化實驗動物模型,檢測大鼠肺組織原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的CDKN2B啟動子甲基化狀態(tài),對其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及機制進行初步研究。方法:1.將36只雄性Wistar大鼠隨機地分成六個組:分別為對照組、模型組(博來霉素肺纖維化組)、非處理對照組、沙塵組(沙塵肺纖維化模型組)、沙塵5'-氮雜胞苷干預(yù)組(沙塵干預(yù)組)及博來霉素5'-氮雜胞苷干預(yù)組(博來霉素干預(yù)組)。對照組給予大鼠氣管灌注生理鹽水;模型組則給予大鼠氣管內(nèi)注射濃度為2.2mg/kg,約0.3ml配制好的博來霉素溶;沙塵組每天暴露于風(fēng)洞模擬的沙塵暴環(huán)境中(設(shè)置總懸浮顆粒物濃度(TSP)約為9000μg/m~3)每周5天,每天5h,其余時間段生活環(huán)境均同非處理對照組;非處理對照組置于風(fēng)洞旁通風(fēng)干燥、恒溫的正常生存環(huán)境中;沙塵干預(yù)組先暴露于風(fēng)洞環(huán)境中(方法劑量同沙塵組),造模1月后予以腹腔注射5'-氮雜胞苷(1mg/kg,1ml);博來霉素干預(yù)組則在博來霉素氣管注射(方法劑量同模型組)4天后給予腹腔注射5'-氮雜胞苷(方法同前);各組造模完成的時間分別為后3周,3周,24周,24周,24周,3周,然后麻醉、處死大鼠。2.評測肺纖維化動物模型構(gòu)建成功與否的方法,包括肺組織蘇木精一伊紅染色(HE染色,Hematoxylin Eosin Staining)、masson三色染色等方法。3.大鼠肺成纖維細(xì)胞進行原代培養(yǎng),提取細(xì)胞總脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA),應(yīng)用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序(Bisulphite pyrosequencing,BSP)方法檢檢測對照組、模型組、非處理對照組、沙塵組大鼠肺成纖維細(xì)胞CDKN2B啟動子的甲基化狀態(tài)。4.利用生物信息學(xué)網(wǎng)站(KEGG PATHWAY Database)及生物醫(yī)學(xué)與信息學(xué)檢索網(wǎng)站PubMed,預(yù)測CDKN2B與纖維化相關(guān)的通路及上下游的靶基因。5.利用蛋白質(zhì)印記(Western-blot)初步分析相關(guān)靶基因的表達。結(jié)果:1、對照組、模型組、博來霉素干預(yù)組、非處理對照組、沙塵組、沙塵干預(yù)組大鼠肺臟進行解剖分離、固定和染色,發(fā)現(xiàn)模型組、沙塵組均可引起不同程度的肺部損傷,包括肺部炎癥、伴肺間質(zhì)纖維組織增生、肺部小結(jié)節(jié)形成,而經(jīng)腹腔注射5'-氮雜胞苷干預(yù)的沙塵干預(yù)組大鼠肺部炎癥及纖維組織增生較沙塵組減少,博來霉素干預(yù)組大鼠肺部炎癥及纖維組織增生較博來霉素組無明顯變化或加重。2、沙塵組大鼠的肺成纖維細(xì)胞中CDKN2B啟動子甲基化狀態(tài)明顯高于非處理對照組。3、對照組和模型組中CDKN2B啟動子甲基化狀態(tài)沒有明顯差異。4、CDKN2B高甲基化的沙塵組,其成纖維細(xì)胞的a-SMA表達增強。5、沙塵組的p-Smads蛋白表達高于非處理對照組。結(jié)論:1、大鼠肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)表明:沙塵顆粒物致肺纖維化的大鼠肺成纖維細(xì)胞中CDKN2B基因啟動子區(qū)域存在高甲基化。2、CDKN2B基因甲基化可能是沙塵致肺纖維化形成的機制之一,即CDKN2B甲基化激活TGF-β/Smads這一信號通路,參與肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。3、博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的發(fā)生與CDKN2B基因的甲基化無關(guān)。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 實驗方法1.沙塵顆粒物采集 實驗沙塵顆粒采集自內(nèi)蒙古阿拉善高原和河西采樣法，采樣區(qū)附近沒有大的障礙物、污染源，從現(xiàn)場收集后，過質(zhì)（微生物材料，硫酸，硝酸鹽，等有毒物質(zhì)），制備實驗用沙塵2.沙塵模擬 實驗中應(yīng)用改良型風(fēng)洞（圖 1），先將沙塵顆粒物注入采用高壓壓縮技術(shù)，形成高濃度沙塵云，經(jīng)濃縮器底部進入實驗倉調(diào)控沙塵顆粒物總濃度為 9000ug/m3，風(fēng)速為 8m/s[23]。實驗用參數(shù)PM 對大鼠肺組織病理學(xué)影響的研究及所獲得的專利[24, 25]。

研究生學(xué)位論文 間經(jīng) t 檢驗，結(jié)果顯示，p＜0.05，差異顯著(圖 4)。這大鼠肺臟發(fā)生較為嚴(yán)重的慢性炎癥反應(yīng)；5＇-氮雜胞苷去顯降低。沙塵顆粒物誘導(dǎo)大鼠肺臟發(fā)生炎癥反應(yīng)、纖維基化起作用，表明 5＇-氮雜胞苷對沙塵誘導(dǎo)的肺纖維化用。

圖 4 A 為沙塵組大鼠肺部 HE 染色（10x）:肺泡壁、肺間質(zhì)內(nèi)可見較多炎癥細(xì)胞浸潤，局部肺泡間隔增厚、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、紊亂，局部可見大量暗灰色沙塵顆粒物沉積。B 為非處理對照組大鼠肺臟 HE 染色（10x）：可見肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁光整，無增厚，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。C 為沙塵干預(yù)組大鼠肺臟 HE 染色（10x）：可見大部分肺泡結(jié)構(gòu)完整，局部肺泡結(jié)構(gòu)破壞及少量沙塵顆粒物沉積區(qū)，炎癥浸潤范圍與滲出物范圍小、程度低。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 雷豐豐;黨雅梅;張正偲;劉華;陳其章;桑迎竹;;沙塵暴對大鼠肺組織影響的病理學(xué)觀察[J];中華病理學(xué)雜志;2015年03期

2 張德平;;特發(fā)性肺纖維化合并肺癌[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2012年09期

3 賀蓉;鄒德學(xué);余振東;郭斂容;;鼻咽癌組織中細(xì)胞周期相關(guān)基因CDKN2B/p15的表達及臨床意義[J];中國實驗診斷學(xué);2009年05期

本文編號：2839305