背景:肺纖維化是一種嚴重的結(jié)構(gòu)破壞性肺間質(zhì)疾病,其特點為早期肺上皮細胞炎癥,隨著病程進展,肺成纖維細胞/肌成纖維細胞過度活化,所產(chǎn)生的大量細胞外基質(zhì)沉積在肺間質(zhì),從而破壞正常的肺部結(jié)構(gòu)。雖然其致病原因不明且治療手段較少,但已有證據(jù)表明,基因?qū)W和表觀遺傳學改變,比如DNA甲基化,在其中起著至關重要的作用。已有的大量研究表明,肺成纖維細胞是肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的關鍵效應細胞。最近的一些研究證實,CDKN2B基因在肺纖維化病人肺成纖維細胞中存在差異甲基化狀態(tài),但其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機制,目前尚沒有相關報道。目的:通過構(gòu)建肺纖維化實驗動物模型,檢測大鼠肺組織原代培養(yǎng)的成纖維細胞的CDKN2B啟動子甲基化狀態(tài),對其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及機制進行初步研究。方法:1.將36只雄性Wistar大鼠隨機地分成六個組:分別為對照組、模型組(博來霉素肺纖維化組)、非處理對照組、沙塵組(沙塵肺纖維化模型組)、沙塵5'-氮雜胞苷干預組(沙塵干預組)及博來霉素5'-氮雜胞苷干預組(博來霉素干預組)。對照組給予大鼠氣管灌注生理鹽水;模型組則給予大鼠氣管內(nèi)注射濃度為2.2mg/kg,約0.3ml配制好的博來霉素溶;沙塵組每天暴露于風洞模擬的沙塵暴環(huán)境中(設置總懸浮顆粒物濃度(TSP)約為9000μg/m~3)每周5天,每天5h,其余時間段生活環(huán)境均同非處理對照組;非處理對照組置于風洞旁通風干燥、恒溫的正常生存環(huán)境中;沙塵干預組先暴露于風洞環(huán)境中(方法劑量同沙塵組),造模1月后予以腹腔注射5'-氮雜胞苷(1mg/kg,1ml);博來霉素干預組則在博來霉素氣管注射(方法劑量同模型組)4天后給予腹腔注射5'-氮雜胞苷(方法同前);各組造模完成的時間分別為后3周,3周,24周,24周,24周,3周,然后麻醉、處死大鼠。2.評測肺纖維化動物模型構(gòu)建成功與否的方法,包括肺組織蘇木精一伊紅染色(HE染色,Hematoxylin Eosin Staining)、masson三色染色等方法。3.大鼠肺成纖維細胞進行原代培養(yǎng),提取細胞總脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA),應用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序(Bisulphite pyrosequencing,BSP)方法檢檢測對照組、模型組、非處理對照組、沙塵組大鼠肺成纖維細胞CDKN2B啟動子的甲基化狀態(tài)。4.利用生物信息學網(wǎng)站(KEGG PATHWAY Database)及生物醫(yī)學與信息學檢索網(wǎng)站PubMed,預測CDKN2B與纖維化相關的通路及上下游的靶基因。5.利用蛋白質(zhì)印記(Western-blot)初步分析相關靶基因的表達。結(jié)果:1、對照組、模型組、博來霉素干預組、非處理對照組、沙塵組、沙塵干預組大鼠肺臟進行解剖分離、固定和染色,發(fā)現(xiàn)模型組、沙塵組均可引起不同程度的肺部損傷,包括肺部炎癥、伴肺間質(zhì)纖維組織增生、肺部小結(jié)節(jié)形成,而經(jīng)腹腔注射5'-氮雜胞苷干預的沙塵干預組大鼠肺部炎癥及纖維組織增生較沙塵組減少,博來霉素干預組大鼠肺部炎癥及纖維組織增生較博來霉素組無明顯變化或加重。2、沙塵組大鼠的肺成纖維細胞中CDKN2B啟動子甲基化狀態(tài)明顯高于非處理對照組。3、對照組和模型組中CDKN2B啟動子甲基化狀態(tài)沒有明顯差異。4、CDKN2B高甲基化的沙塵組,其成纖維細胞的a-SMA表達增強。5、沙塵組的p-Smads蛋白表達高于非處理對照組。結(jié)論:1、大鼠肺成纖維細胞原代培養(yǎng)表明:沙塵顆粒物致肺纖維化的大鼠肺成纖維細胞中CDKN2B基因啟動子區(qū)域存在高甲基化。2、CDKN2B基因甲基化可能是沙塵致肺纖維化形成的機制之一,即CDKN2B甲基化激活TGF-β/Smads這一信號通路,參與肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。3、博來霉素誘導的肺纖維化的發(fā)生與CDKN2B基因的甲基化無關。
【學位單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

寧夏醫(yī)科大學碩士研究生學位論文 實驗方法1.沙塵顆粒物采集 實驗沙塵顆粒采集自內(nèi)蒙古阿拉善高原和河西采樣法，采樣區(qū)附近沒有大的障礙物、污染源，從現(xiàn)場收集后，過質(zhì)（微生物材料，硫酸，硝酸鹽，等有毒物質(zhì)），制備實驗用沙塵2.沙塵模擬 實驗中應用改良型風洞（圖 1），先將沙塵顆粒物注入采用高壓壓縮技術(shù)，形成高濃度沙塵云，經(jīng)濃縮器底部進入實驗倉調(diào)控沙塵顆粒物總濃度為 9000ug/m3，風速為 8m/s[23]。實驗用參數(shù)PM 對大鼠肺組織病理學影響的研究及所獲得的專利[24, 25]。

研究生學位論文 間經(jīng) t 檢驗，結(jié)果顯示，p＜0.05，差異顯著(圖 4)。這大鼠肺臟發(fā)生較為嚴重的慢性炎癥反應；5＇-氮雜胞苷去顯降低。沙塵顆粒物誘導大鼠肺臟發(fā)生炎癥反應、纖維基化起作用，表明 5＇-氮雜胞苷對沙塵誘導的肺纖維化用。

圖 4 A 為沙塵組大鼠肺部 HE 染色（10x）:肺泡壁、肺間質(zhì)內(nèi)可見較多炎癥細胞浸潤，局部肺泡間隔增厚、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、紊亂，局部可見大量暗灰色沙塵顆粒物沉積。B 為非處理對照組大鼠肺臟 HE 染色（10x）：可見肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁光整，無增厚，無明顯炎癥細胞浸潤。C 為沙塵干預組大鼠肺臟 HE 染色（10x）：可見大部分肺泡結(jié)構(gòu)完整，局部肺泡結(jié)構(gòu)破壞及少量沙塵顆粒物沉積區(qū)，炎癥浸潤范圍與滲出物范圍小、程度低。
【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 雷豐豐;黨雅梅;張正偲;劉華;陳其章;桑迎竹;;沙塵暴對大鼠肺組織影響的病理學觀察[J];中華病理學雜志;2015年03期

2 張德平;;特發(fā)性肺纖維化合并肺癌[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2012年09期

3 賀蓉;鄒德學;余振東;郭斂容;;鼻咽癌組織中細胞周期相關基因CDKN2B/p15的表達及臨床意義[J];中國實驗診斷學;2009年05期

本文編號：2839305