背景 支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,屬于超敏反應(yīng)性質(zhì),多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子與其發(fā)生發(fā)展有關(guān),其中輔助T細胞亞群(Th1/Th2)的失衡、Th2細胞數(shù)量增加、功能活化起著關(guān)鍵作用。樹突狀細胞是目前已知的功能最強的抗原遞呈細胞(APC),系已知唯一能活化初始T細胞的APC,是識別內(nèi)外源性抗原、調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵因素。已知分布于氣道的DC是呼吸道免疫防御的前哨細胞,在通過胞飲、吞噬或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞三種方式攝取吸入性抗原后逐漸成熟,趨化因子、共刺激分子和MHCI工類分子表達增加,而FcγRII、FcγRI和FcεRI等表達減少,并于24小時內(nèi)從氣道遷移至縱隔淋巴結(jié)產(chǎn)生初級免疫應(yīng)答,促使初始Th細胞(Th0)向Th1或Th2分化。Tho的活化需DC參與的抗原識別信號和協(xié)同刺激信號,其分化方向受控于抗原刺激后DC分泌的細胞因子,IL-12和IFN—γ是誘導(dǎo)Th0向Th1分化的重要細胞因子。許多試驗顯示DC的免疫調(diào)節(jié)作用與其細胞膜表面TLR的表達有關(guān),一般認為相應(yīng)P/NP通過TLR4激活DC主要引起IL-12p70、IFN-γ介導(dǎo)蛋白(IP-10)等細胞因子大量增加。鑒于樹突狀細胞TLR4對于T細胞分化的調(diào)節(jié)作用,若將TLR4基因通過腺病毒載體導(dǎo)入抗原(如LPS)激發(fā)的DC,可促使DC分泌較多的IFN-γ等,上調(diào)Th0表達的IL-12Rβ2和TLR4,從而利于Th0向Th1分化。 目的將轉(zhuǎn)染了TLR4基因和LPS致敏的DC輸入OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型小鼠體內(nèi),以促進Th1的分化,逆轉(zhuǎn)過敏性哮喘的Th亞群失衡,從而通過TLR4基因轉(zhuǎn)移DC干預(yù)的免疫調(diào)節(jié)方式探討哮喘基因治療的新方法。 方法 1.利用RT-PCR方法,從Balb/c小鼠脾組織細胞mRNA中擴增TLR4基因全長cDNA,并將其連接到pcDNA3.1(+)載體上,進行測序和核酸分析。 2.采用AdMax包裝系統(tǒng),將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞,利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組,產(chǎn)生重組腺病毒。RT-PCR方法檢測AdV-TLR4mRNA在傳代DC中的表達、Western Blot方法檢測AdV-TLR4蛋白的表達。 3.RT-PCR方法檢測AdV-TLR4轉(zhuǎn)染的DCIL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA表達的變化;ELISA方法檢測AdV—TLR4轉(zhuǎn)染的DC培養(yǎng)上清IL-12、IL-4和IFN-Y的表達水平;流式細胞儀分析AdV—TLR4轉(zhuǎn)染的DC表面免疫特性標(biāo)志蛋白Ia、CD40、CD80和CD 86的改變。 4.0.1%OVAAl(0H)_3溶液皮下注射、1%OVA的生理鹽水溶液霧化吸入的方法制備小鼠哮喘模型;福爾馬林組織固定、包埋、切片,HE染色和AB/PAS復(fù)染進行小鼠肺組織學(xué)形態(tài)觀察,Gimsa-Wright染色觀察BALF中Eos;骨髓細胞分離,紅細胞裂解液處理,GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)、RMPI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式獲取DC,行哮喘小鼠DCTLR4mRNA和TLR4蛋白表達檢測;ELISA方法檢測小鼠脾細胞IL-4、IL-5、IFN-Y和血漿IgE含量、人血漿IL-4和IgE含量、BALF中IL-4和IgE含量;流式細胞儀方法檢測脾細胞CD4+CD25+細胞百分比。 結(jié)果 1.擴增得到的小鼠TLR4基因cDNA全長2508bp,編碼536個氨基酸,blast結(jié)果分析表明,該cDNA與Genbank中發(fā)表的序列(NM021297)具有100%的同源性。 2.重組質(zhì)粒pDC316—mTLR4的PCR及酶切鑒定表明,TLR4基因被定向插入;與pBHGF35骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞并包裝成病毒,經(jīng)病毒DNA的PCR檢測,證實已完成對重組病毒的包裝;重組病毒轉(zhuǎn)染小鼠DC,其TLR4mRNA和TLR4蛋白均明顯表達。 3.誘導(dǎo)Th1細胞分化的IL-12、IFN-γ在Ad-TLR4轉(zhuǎn)染DC后48小時表達量明顯增高,而誘導(dǎo)Th2細胞分化的IL-4表達量明顯降低;轉(zhuǎn)染細胞的PCR檢測顯示IL-12 mRNA、IL-4 mRNA和IFN-Y mRNA的變化與相應(yīng)蛋白表達量的變化具有一致性;LPS實驗進一步證實顯示,LPS對轉(zhuǎn)染細胞表達細胞因子的影響與LPS有關(guān),LPS(+)轉(zhuǎn)染DC組上述細胞因子改變的幅度高于LPS(-)組,LPS具有促進和加強Ad-TLR4-DC的某些生物學(xué)特性的改變。流式細胞檢測表明Ad5F35-mTLR4組DC細胞CD 86表達較對照組和Ad5F35一mCMV-EGFP明顯增高;進一步的實驗顯示,Ad5F35-mTLR4轉(zhuǎn)染DC LPS(+)組Ia、CD40和CD80表達較相應(yīng)LPS(-)明顯增高;LPS(+)對照組CD80和CD 86表達也較相應(yīng)LPS(-)組明顯增高。LPS具有促進和加強Ad-TLR4-DC細胞表面某些免疫特性標(biāo)志蛋白的改變。 4.TLR4 DC懸液給予過敏性哮喘模型小鼠,顯示表現(xiàn)為杯狀細胞增生減少、氣道內(nèi)粘液減少,WBC數(shù)、Eso比率和IL-4水平均降低,而免疫調(diào)節(jié)性T細胞CD4+CD25+細胞百分率增高,顯示TLR4 DC具有明顯的抗支氣管哮喘作用。TLR4 DC抗支氣管哮喘的機制,推測與TLR4 DC激發(fā)使具有調(diào)節(jié)T細胞分化的細胞因子改變有關(guān),如IFN-γ增加可促使Th1分化;TLR4DC進入機體還促使了免疫調(diào)節(jié)性T細胞CD4+CD25+增加,免疫調(diào)節(jié)性T細CD4+CD25+可增加機體對過敏物質(zhì)的耐受性,進而可減輕其炎癥反應(yīng)。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建了小鼠TLR4基因的全長編碼區(qū)cDNA。 2.重組病毒感染滴度為2.3×10~8 IU/ml,可用于體內(nèi)外動物實驗。在本研究中作為TLR4基因干預(yù)對機體Th1/Th2平衡影響的研究工具。 3.LPS促進Ad-TLR4-DC細胞表面Ia、CD40、CD80和CD 86免疫特性標(biāo)志蛋白改變,促進DCIL-12、IL-4和IFN-γ表達改變,推測這些改變與DCTLR4信號傳導(dǎo)有關(guān)。 4.TLR4 DC對OVA誘導(dǎo)的支氣管炎癥反應(yīng)有一定抑制作用,LPS與TLR4有一定的協(xié)調(diào)作用,其機制與DC的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R562.25
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 TLRs與哮喘炎癥細胞和食品營養(yǎng)關(guān)系研究
    1.1 引言
    1.2 支氣管哮喘免疫學(xué)
    1.3 TLR的生物學(xué)
    1.4 TLRs及T淋巴細胞與支氣管哮喘
        1.4.1 TLR在Th1型免疫應(yīng)答中的作用
        1.4.2 TLRs在Th2型免疫應(yīng)答中的作用
    1.5 TLRs及肥大細胞與支氣管哮喘
    1.6 TLRs及肺上皮細胞與支氣管哮喘
        1.6.1 支氣管上皮細胞與哮喘
        1.6.2 Ⅱ型上皮細胞與哮喘
        1.6.3 TLR s和Ⅱ型上皮細胞在哮喘中的作用
    1.7 TLRs及DC與支氣管哮喘
    1.8 DC和TLRs干預(yù)治療支氣管哮喘展望
    1.9 TLRs與食品營養(yǎng)關(guān)系
        1.9.1 益生菌及作用機制
        1.9.2 TLR、食品與健康
    參考文獻
第二章 小鼠TLR4基因克隆和鑒定
    2.1 引言
    2.2 實驗材料和儀器
        2.2.1 料和試劑
        2.2.2 主要實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 引物設(shè)計與合成
        2.3.2 小鼠脾組織細胞總RNA的提取
        2.3.3 RT-PCR
        2.3.4 PCR產(chǎn)物的DNA重組和克隆
        2.3.5 陽性克隆的篩選
        2.3.6 鑒定與分析
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 RT PCR擴增TLR4基因
        2.4.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)TLR4的酶切及PCR鑒定
        2.4.3 小鼠TLR4基因的序列分析
    2.5 分析討論
        2.5.1 小鼠TLR4基因的表達蛋白
        2.5.2 小鼠TLR4基因
        2.5.3 小鼠TLR4基因克隆及其對支氣管哮喘的意義
    參考文獻
第三章 小鼠TLR4基因腺病毒載體的構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 實驗材料和儀器
        3.2.1 材料和試劑
        3.2.2 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 含目標(biāo)基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 陽性克隆的篩選與鑒定
        3.3.3 構(gòu)建后質(zhì)粒鑒定
        3.3.4 重組腺病毒在293細胞中的包裝
        3.3.5 Ad5F35-mTLR4鑒定
        3.3.6 病毒活性確定
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 穿梭質(zhì)粒連接產(chǎn)物鑒定
        3.4.2 含pDC316-mTLR4菌液的PCR鑒定
        3.4.3 pDC316-mTLR4質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.4.4 pDC316-mTLR4測序鑒定
        3.4.5 293細胞中Ad V-TLR4病毒包裝
        3.4.6 Ad5F35-mTLR4的PCR鑒定
    3.5 討論
        3.5.1 病毒載體
        3.5.2 病毒載體的包裝系統(tǒng)
        3.5.3 病毒載體的純化
        3.5.4 腺病毒及其腺病毒載體
        3.5.5 常用腺病毒載體的包裝方法
        3.5.6 腺病毒載體Ad5/F35
        3.5.7 Ad5F35-mTLR4
    參考文獻
第四章 TLR4腺病毒載體轉(zhuǎn)染在DC的表達觀察
    4.1 引言
    4.2 實驗材料和儀器
        4.2.1 材料和試劑
        4.2.2 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 DC的倒置顯微鏡和電鏡觀察
        4.3.2 病毒載體侵染DC細胞Ad5F35-mTLR4感染DC細胞:
        4.3.3 適當(dāng)MOI值確定
        4.3.4 TLR4mRNA定性表達檢測
        4.3.5 TLR4mRNA定量表達檢測
        4.3.6 TLR4蛋白表達檢測
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 DC形態(tài)學(xué)觀察
        4.4.2 MOI值確定
        4.4.3 Ad5F35-mTLR4感染DC表達檢測
    4.5 討論
        4.5.1 DC疫苗
        4.5.2 DC疫苗目前的應(yīng)用
        4.5.3 ad-TLR4-DC
    參考文獻
第五章 TLR4腺病毒載體轉(zhuǎn)染對DC表面標(biāo)志和細胞因子表達的體外實驗觀察
    5.1 引言
        5.1.1 DC與支氣管哮喘
        5.1.2 支氣管哮喘與細胞因子紊亂
        5.1.3 體外實驗觀察的意義
    5.2 實驗材料和儀器
        5.2.1 材料和試劑
        5.2.2 實驗儀器
    5.3 實驗方法
        5.3.1 DC培養(yǎng)和分組
        5.3.2 DC表面標(biāo)志檢測
        5.3.3 培養(yǎng)DC上清IL-12、IL-4和IFN-γ表達檢測
        5.3.4 培養(yǎng)DCIL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA表達檢測
        5.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    5.4 結(jié)果
        5.4.1 Ad5F35-mTLR4轉(zhuǎn)染對DC表面標(biāo)志的影響
        5.4.2 Ad5F35-mTLR4轉(zhuǎn)染對DCIL-12、IL-4和IFN-γ表達的影響
        5.4.3 Ad5F35-mTLR4轉(zhuǎn)染DC對IL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA的影響
        5.4.4 LPS對不同DC組表面標(biāo)志的影響
        5.4.5 LPS對不同DC組IL-12、IL-4和IFN-γ的影響
        5.4.6 LPS對不同DC組IL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA表達的影響
    5.5 分析討論
        5.5.1 TLR信號傳導(dǎo)系統(tǒng)
        5.5.2 Ia、CD40、CD80和CD86
        5.5.3 ID-12 IL-4和IFN-γ
        5.5.4 LPS脂多糖(Lipopolysacchride,LPS)
        5.5.5 TLR4對DC表面標(biāo)志和細胞因子表達的影響
    參考文獻
第六章 哮喘及TLR4轉(zhuǎn)染DC體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能觀察
    6.1 引言
        6.1.1 基因治療概述
        6.1.2 以腺病毒載體為基礎(chǔ)的基因治療
        6.1.3 以DC為基礎(chǔ)的基因治療
        6.1.4 TLR4基因?qū)隓C的基因療法
    6.2 實驗材料和儀器
        6.2.1 材料和試劑
        6.2.2 實驗儀器
    6.3 實驗方法
        6.3.1 小鼠哮喘模型制備
        6.3.2 小鼠肺組織學(xué)檢測
        6.3.3 哮喘模型小鼠DC分離培養(yǎng)
        6.3.4 哮喘模型小鼠DC TLR4mRNA
        6.3.5 小鼠DC蛋白的提取及TLR4蛋白的Western Blotting檢測
        6.3.6 哮喘患兒血漿IL-4、IgE測定
        6.3.7 老年性哮喘患者血漿和支氣管灌洗液IL-4相關(guān)性分析
        6.3.8 TLR4轉(zhuǎn)染DC的免疫調(diào)節(jié)功能觀察
        6.3.9 小鼠TLR4DC制備
        6.3.10 小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)白細胞和Eos檢測
        6.3.11 小鼠脾細胞IL-4、IL-5、IFN-γ和血漿IgE含量測定
        6.3.12 小鼠脾細胞CD4+CD25+細胞的百分比檢測
        6.3.13 統(tǒng)計學(xué)處理
    6.4 結(jié)果
        6.4.1 哮喘模型小鼠肺組織學(xué)改變
        6.4.2 哮喘模型小鼠脾細胞培養(yǎng)上清細胞因子改變
        6.4.3 哮喘模型小鼠DC TLR4蛋白表達
        6.4.4 哮喘模型小鼠DC TLRmRNA分析
        6.4.5 不同人群IL-4、IgE及相關(guān)性檢測
        6.4.6 TLR4DC對哮喘小鼠肺支氣管組織形態(tài)的影響
        6.4.7 TLR4DC對哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液過敏炎癥細胞數(shù)的影響
        6.4.8 TLR4DC對哮喘小鼠脾淋巴細胞IL-4、ID-5、IFN-γ和血清IgE的影響
        6.4.9 TLR4DC對哮喘小鼠脾淋巴細胞活性的影響
    6.5 分析討論
        6.5.1 DC臨床應(yīng)用情況
        6.5.2 DC在支氣管哮喘治療中的應(yīng)用
        6.5.3 ad-TLR4DC與支氣管哮喘免疫調(diào)節(jié)
    參考文獻
第七章 工作總結(jié)與展望
    7.1 主要結(jié)論
    7.2 研究創(chuàng)新
    7.3 工作展望
        7.3.1 病毒載體的免疫原性和安全性檢測
        7.3.2 安全、高效、靶向和可調(diào)控病毒載體的研究和使用
        7.3.3 基因修飾DC的免疫治療問題
        7.3.4 DC表面TLR研究
        7.3.5 DC的免疫耐受研究
        7.3.6 Tc1和Tc2群與DC關(guān)系
        7.3.7 臨床基因治療
    參考文獻
在讀期間發(fā)表的第一作者學(xué)術(shù)論文
致謝

【參考文獻】

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