1.研究背景 支氣管哮喘是危害人類健康的常見病,以氣道高反應性和氣道重構為其主要特點,氣道平滑肌增殖是導致哮喘氣道重構的重要原因。因此對哮喘支氣管平滑肌細胞增殖的研究就成為了熱點。目前認為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路在支氣管平滑肌增殖中起到了重要的作用。 2.研究目的 本研究旨在探討細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信號通路在組胺誘導的大鼠氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)增殖中的調(diào)控作用。 3.方法 以體外分離、培養(yǎng)的ASMCs為研究對象,加入不同濃度組胺(histanmine, Hist)和PD98059對其進行處理,采用四甲基偶氮唑藍(MTT)微量比色法檢測Hist及ERK信號通路對ASMCs增殖的影響,Western blot檢測ERK1/2、磷酸化ERK1/2 (phosphorylated-ERK1/2,p-ERK1/2)蛋白的表達,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定ASMCs核內(nèi)NF-κB水平,并對各組進行比較。 4.結果 低濃度和高濃度的Hist均能不同程度刺激ASMCs增殖,100μmol/L時細胞存活率達201.3%;Hist組ASMCs增殖反應與對照組相比顯著增加,而Hist+PD980059組ASMCs的增殖反應顯著低于Hist組;Hist組ASMCs中的p-ERK1/2蛋白表達較正常對照組明顯增強,在加入PD980059后Hist誘導的活化ERK1/2相對于Hist組表達顯著下降;Hist處理組NF-κB吸光度值顯著高于對照組,Hist+PD98059組NF-κB吸光度值較Hist處理組顯著降低。 5.結論 Hist可顯著誘導ASMCs增殖,ERK信號通道在此調(diào)控中起重要作用,而且還可能參與ASMCs中Hist誘導的NF-κB活化。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

隨機選取部分原代培養(yǎng)細胞，光鏡下見大鼠氣道平滑肌細胞呈梭形，呈“峰和谷”生長狀態(tài)，應用平滑肌特異α-actinSP即用型試劑盒進行純度鑒定，細胞核為卵圓形位于靠近胞質(zhì)的中央，且氣道平滑肌純度>95%。見圖1，從而證實取自大鼠所分離、培養(yǎng)的細胞為氣道平滑肌。圖1 細胞α-actin免疫細胞化學陽性染色Fig1 Cell α-actin positive staining immunocytochemistry3.2 MTT檢測氣道平滑肌細胞增殖MTT法常用于檢測細胞存活和生長。MTT法的基本原理是：在活細胞的線粒體脫氫酶和細胞色素C的作用下，tetrazolium環(huán)開裂能將染料MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿乃{紫色甲瓚顆粒，后者的生成量與細胞數(shù)目和/或細胞活性呈正相關，用二甲亞砜溶解所生成的甲瓚顆粒，通過檢測光密度值變化，可間接反映細胞生長、增殖活性及活細胞數(shù)量。利用酶標儀測定490nm處的光密度的OD值，結果顯示組胺可誘導氣道平滑肌增殖，且其增值效應具有劑量依賴性。圖2顯示

特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。蛋白印跡分析的結果以內(nèi)參β-actin 進行半定量分析比較各組，結果表明組胺處理組活化形式的p-ERK1和p-ERK2 在大鼠氣道平滑肌中的蛋白表達較正常對照組明顯增強(圖3)，同時其總ERK1和ERK2 的蛋白表達比對照組也略有增強，而在加入PD98059后組胺誘導的活化ERK1和ERK2蛋白表達量顯著下降，與對照組無明顯差異，而兩組總ERK1ERK2蛋白表達量變化不明顯。對照組 Hist組 Hist+PD98059組圖3 蛋白印跡分析結果Fig3 Western blot analysis3.4 ELISA法測量氣道平滑肌細胞的NF-κB水平Sandwich ELISA的原理是將特異性抗體結合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢的相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體，與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，后用酶標儀檢測吸光度值，從而判斷抗原含量。通過Sandwich ELISA技術得出數(shù)據(jù)看出：組胺處理組NF-κB吸光度值顯著高于對照組(P<0.01); 組胺+PD98059組NF-κB吸光度值較組胺處理組顯著降低(P<0.01)
【參考文獻】

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本文編號：2836754