研究背景 嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome，mARS)是一種以呼吸道癥狀為主的急性傳染病，其主要病變以急性肺損傷(acute lunginjury，ALI)為主，可合并全身多臟器損害，病死率較高，引起國際社會廣泛關(guān)注和醫(yī)學(xué)界的高度重視。在各國醫(yī)學(xué)專家的共同努力下，2003年4月16日世界衛(wèi)生組織(WHO)正式宣布，mARS是由一種新型冠狀病毒引起，并命名為SARm冠狀病毒(SARm coronavirus，SARS-CoV)。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2002～2003年SARS流行期間，全球共有8400名確診病例，約900余名患者死亡，由于該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率及死亡率高，被譽(yù)為21世紀(jì)初世界范圍內(nèi)發(fā)生的重大事件之一。 廣東省曾是我國SARS發(fā)病最早，發(fā)病率最高，影響最大的省份，為弄清SARS病因及發(fā)病機(jī)制，我們在當(dāng)時(shí)對本病認(rèn)識不清，無特殊防護(hù)條件下，開展了國際首例和較早的3例尸檢，雖然目前在病原學(xué)及流行病學(xué)等方面取得重大進(jìn)展，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此我們利用4例尸檢資料，對mARS-CoV在全身組織和器官的分布及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，希望對mARS及其它呼吸道病毒疾病的預(yù)防和治療提供有用信息。 目的 1．對病變組織內(nèi)病毒包涵體、病毒顆粒以及SARS-CoV N基因及S基因進(jìn)行原位檢測，觀察SARS-CoV在全身組織和器官的分布、探討SARS-CoV傳播途徑及致病機(jī)制； 2．通過觀察SARS尸檢組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2)與SARS-CoV S蛋白的分布，探討ACE2和SARS-CoY S蛋白在SARS尸檢組織中的表達(dá)及其相互作用關(guān)系； 3．通過檢測免疫細(xì)胞標(biāo)志物及細(xì)胞因子(CD3、CD4、CD8、CDl6、CD20、CD25、CD45RO、CD68、Ki67、Mac387、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1)在SARS病變組織中的表達(dá)，分析它們在SARS發(fā)病中的作用； 4．通過檢測SARS病變組織的細(xì)胞凋亡情況，闡述細(xì)胞凋亡在SARS發(fā)病中的作用機(jī)制。 材料和方法 收集2003年3月至5月期間第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院病理科4例SARS完整尸體解剖資料，分別取肺、氣管、心臟、肝、腎、腎上腺、脾、食道、胃、小腸、胰腺、腦、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、淋巴結(jié)、皮膚、子宮、卵巢以及睪丸等組織，4例尸檢病例均符合WHO SARS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，以心源性猝死患者相應(yīng)組織作為對照。全部標(biāo)本用4％中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片。 采用組織病理學(xué)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)雙染法、免疫組織化學(xué)與組織化學(xué)雙染法、原位雜交技術(shù)及透射電鏡等方法對4例SARS尸檢組織中病毒包涵體、病毒顆粒、SARS-CoV N基因、SARS-CoV S基因、免疫細(xì)胞標(biāo)志物(CD3、CD4、CD8、CDl6、CD20、CD25、CD45RO、CD68、Ki67、Mac387)、細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1)、功能性受體ACE2以及凋亡細(xì)胞(Klenow-FragEL DNA Fragmentation、Fas／FasL)進(jìn)行檢測。 結(jié)果 1．肺組織病原體原位檢測結(jié)果： 1．1組織病理學(xué)觀察：4例尸檢肺組織部分增生脫落的肺泡上皮細(xì)胞及滲出的單核巨噬細(xì)胞內(nèi)可見病毒包涵體，包涵體多呈球形，約紅細(xì)胞大小，嗜酸性染色，周圍可見透明暈。 1．2組織化學(xué)觀察：對4例SARS肺組織用Macciavello法(病毒包涵體染色)進(jìn)行檢測，3例肺組織肺泡上皮及局部浸潤單核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)典型的病毒包涵體，包涵體紅細(xì)胞大小呈紫紅色。 1．3透射電鏡觀察：肺泡上皮明顯腫脹，內(nèi)漿網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體及內(nèi)漿網(wǎng)明顯空泡變性。Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞增生，尤以Ⅱ型上皮增生明顯。增生的Ⅱ上皮細(xì)胞胞漿板層小體明顯減少或缺如，粗面內(nèi)漿網(wǎng)(PER)及滑面內(nèi)漿網(wǎng)(SER)均大量增生、擴(kuò)張，擴(kuò)張SER池內(nèi)有電子密度增高的蛋白分泌物，部分?jǐn)U張的SER內(nèi)可見群集的、大小較一致的病毒顆粒，表面有細(xì)小的花冠狀微粒，顆粒大小約60-90nm。部分胞核內(nèi)見有膜性層狀包涵體。間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、空泡變性。肺泡腔內(nèi)有少量滲出的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞。 1．4免疫組化觀察：SARS-CoV N蛋白及S蛋白特異性單克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞及漿液腺腺上皮細(xì)胞均呈陽性表達(dá)，正常對照肺組織SARS-CoV N蛋白及S蛋白標(biāo)記陰性。 1．5原位分子雜交觀察：SARS-CoV N及S基因mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞及漿液腺腺上皮細(xì)胞均可見陽性雜交信號；正常對照肺組織SARS-CoV N及S基因mRNA雜交信號陰性。 2．肺外組織病原體原位檢測結(jié)果： 對4例SARS尸檢組織N基因及S基因從蛋白和mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)食道鱗狀上皮、胃壁細(xì)胞、小腸黏膜柱狀上皮細(xì)胞、心肌纖維、腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞、皮膚汗腺上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞、胰腺胰島細(xì)胞、大腦神經(jīng)元、垂體嗜酸性細(xì)胞、肝細(xì)胞及睪丸曲細(xì)精管等均呈陽性表達(dá)；而在SARS脾及淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞、甲狀腺、卵巢、子宮等細(xì)胞或組織未檢測到SARS-CoV N基因及S基因；對照組SARS-CoV N基因及S基因蛋白和mRNA均呈陰性。 3．功能性受體ACE2基因與SARS-CoV S基因檢測結(jié)果比較 對4例SARS尸檢組織ACE2及S基因從蛋白和mRNA水平檢測支氣管、肺、心肌、肝、腎、腎上腺、胃、小腸、胰腺、腦、甲狀腺、甲狀旁腺、皮膚、睪丸、卵巢及子宮等組織發(fā)現(xiàn)肺組織增生和脫落的上皮細(xì)胞及浸潤的單核／巨噬細(xì)胞、氣管及支氣管上皮細(xì)胞及漿液腺腺上皮細(xì)胞、小腸黏膜柱狀上皮細(xì)胞、心肌纖維、胃壁細(xì)胞、腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞、食道粘膜鱗狀上皮、皮膚汗腺上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞、胰腺胰島細(xì)胞、大腦神經(jīng)元、垂體嗜酸性細(xì)胞、肝細(xì)胞及睪丸曲細(xì)精管等蛋白和mRNA檢測均呈陽性；脾臟及淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞、甲狀腺、卵巢及子宮無陽性表達(dá)。蛋白表達(dá)陽性部位定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色；雜交信號定位于細(xì)胞質(zhì)，呈藍(lán)黑色；對照組相應(yīng)組織ACE2基因蛋白和mRNA水平檢測與SARS尸檢組織檢測結(jié)果一致，SARS-CoV S基因蛋白和mRNA水平檢測均呈陰性。 4．病理變化觀察及免疫細(xì)胞標(biāo)志物檢測結(jié)果 肺：病變肺組織呈脫屑性肺泡炎及脫屑性支氣管炎改變，肺泡腔內(nèi)充滿大量脫落和增生的肺泡上皮細(xì)胞，增生脫落的肺泡上皮細(xì)胞體積明顯增大，部分細(xì)胞相互融合呈合體細(xì)胞狀，肺泡腔內(nèi)可見透明膜形成，肺組織局灶性壞死，壞死處可見中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞浸潤；淋巴結(jié)：淋巴濾泡消失，淋巴細(xì)胞呈點(diǎn)片狀壞死，淋巴竇內(nèi)可見大量單核巨噬細(xì)胞增生，部分單核巨噬細(xì)胞呈活化狀態(tài)，經(jīng)Ki67及CD45RO雙染標(biāo)記的T淋巴細(xì)胞呈散在陽性，CD4~+、CD8~+T．淋巴細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)明顯減少；脾：脾小體高度萎縮，紅髓淋巴組織大片狀壞死，壞死灶內(nèi)可見成片的單核巨噬細(xì)胞浸潤；心臟：心肌間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)小血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管壁水腫，可見單核和淋巴細(xì)胞浸潤；肝臟：肝細(xì)胞索明顯解離，肝細(xì)胞脂肪變性及小灶性壞死，可見單核巨噬細(xì)胞浸潤；腎臟及腎上腺組織可見小灶性壞死，腎間質(zhì)小動脈、小靜脈呈血管炎的表現(xiàn)，局部主要浸潤細(xì)胞為單核和淋巴細(xì)胞。 5．細(xì)胞因子檢測結(jié)果 對4例SARS尸檢組織肺、支氣管、食管、胃、小腸、肝、心肌、血管、腎、腎上腺、胰腺、腦組織、甲狀腺、甲狀旁腺、睪丸及皮膚等組織細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1蛋白和mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)肺組織增生和脫落的上皮細(xì)胞及浸潤的單核／巨噬細(xì)胞、氣管及支氣管上皮細(xì)胞及漿液腺腺上皮細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌纖維、腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞、胰腺胰島細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、皮膚汗腺上皮細(xì)胞、腦垂體嗜酸性細(xì)胞均呈不同程度陽性表達(dá)，小腸黏膜柱狀上皮細(xì)胞MCP-1和TGF-β1標(biāo)記顯示陽性、食管鱗狀上皮、甲狀旁腺、睪丸生精上皮及甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞呈陰性表達(dá)。正常對照組腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞TGF-β1及TNF-α呈陽性表達(dá)，余陰性。陽性部位定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。用免疫組織化學(xué)與奧新蘭雙重染色發(fā)現(xiàn)支氣管漿液腺腺上皮細(xì)胞IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1呈棕黃色，而黏液腺上皮細(xì)胞顯示藍(lán)色。 6．細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 經(jīng)Klenow-FragEL DNA Fragmentation、Fas／FasL檢測發(fā)現(xiàn)肺組織、脾臟和淋巴結(jié)的凋亡細(xì)胞明顯增多。病變肺組織的凋亡細(xì)胞主要為肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等；病變淋巴結(jié)和脾臟內(nèi)可見大量淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論 1．SARS是一種全身多器官損傷性疾病，肺是SARS病毒主要攻擊的靶器官，急性肺損傷是本病死亡的主要原因； 2．首次提出SARS除呼吸道和消化道傳播外，還可能通過尿液和皮膚接觸傳播的新觀點(diǎn)； 3．功能性受體ACE2與SARS-CoV S基因在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和定位一致，首次在SARS尸檢組織中確認(rèn)ACE2為SARS-CoV的功能性受體； 4．前炎癥細(xì)胞因子(IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1)與SARS-CoV S蛋白及受體ACE2在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一致，提示SARS-CoV感染的細(xì)胞可能過度分泌PlCs(proinflammatory cytokines，Pies)，引起免疫介導(dǎo)的肺和其它器官損害，導(dǎo)致ALI和全身多器官機(jī)能障礙； 5．細(xì)胞凋亡可能在ALI發(fā)生中起重要作用。
【學(xué)位單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2006
【中圖分類】：R511.9
【部分圖文】：

4擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)充滿下

圖卜7支氣管漿液腺州蛋白，IHC)SARS一 CoVNproteinexPression圖1一8皮膚汗腺(N蛋白，IHC) inbronehialserousglandePithelium(Figurel一7)and sweatglandcells(Figurel一 8)byIHC、氣、心、謬每俗如擎?zhèn)湫揖春簋A，·公、‘O、藕*一藝。尹圖1一9腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞困蛋白，IHC)圖1一10腦垂體嗜酸性細(xì)胞困蛋白，IHC)SARS一 CoVNProteinexPreacidoPhilie ssionindistaleonvolutedrenaltubules(Figure]一9)and eellsofPituitary(Figurel一 10)byIHC

診份i嘿鉀孤圖卜5肺泡上皮細(xì)胞(N蛋白，IHC)圖1一單核巨噬細(xì)胞伽蛋白，IHC)Figurel一5， 6SARS一 CoVNproteinexpressioninpneumocytesandmonocytes·侮謬_男t、斗.鷺黔、恤、，，擴(kuò).籌‘泰瀟沙蛇夸產(chǎn)竺二今佗鏟、戶襲翻一匆兮戶加，稱，每翻圣.‘滬:礦矛丈J蒸扮…、尹曝粼群‘’、.丫冬，廠今‘戚…羨孑淤廠汾戶毅如沖夢腸泊圖卜7支氣管漿液腺州蛋白，IHC)SARS一 CoVNproteinexPression圖1一8皮膚汗腺(N蛋白

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊瑞鋒,徐國賓,閆存玲,張國華,李海霞,夏鐵安;SARS冠狀病毒的生物學(xué)性狀及實(shí)驗(yàn)室檢測方法研究進(jìn)展[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年S1期

2 陸源,宮恩聰,張黔英,顧江,李興旺,張波,侯琳,邵宏權(quán),高子芬,鄭杰,方偉崗,鐘延豐;嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒在肺組織內(nèi)各種類型細(xì)胞中的表達(dá)[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年05期

3 王嘉麗,張俊磊;SARS病毒的研究進(jìn)展[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年09期

4 賴晃文,賴日權(quán),田野,楊傳紅,張偉,馮曉冬,王卓才;體液免疫在SARS發(fā)病機(jī)制中的作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年14期

5 車小燕,丘立文,潘玉先,徐華,郝衛(wèi),廖志勇,梅亞波,張麗婭,萬卓越,袁國勇,黃震;SARS冠狀病毒N蛋白單克隆抗體的快速、高效制備的方法研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年07期

6 張慶玲,丁彥青,賀莉,王蔚,張進(jìn)華,王慧君,蔡俊杰,耿艦,陸藥丹,羅元龍;SARS病變組織細(xì)胞凋亡檢測及其意義[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年08期

7 賀莉,丁彥青,王蔚,張慶玲,張進(jìn)華,耿艦,蔡俊杰,王慧君;免疫細(xì)胞在SARS病變組織中的表達(dá)及其作用[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年08期

8 丁彥青;嚴(yán)重急性呼吸綜合征的病理學(xué)及發(fā)病機(jī)制[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2003年06期

9 孫艷玲,趙景民,王松山,楊建法,周光德,潘登,李文淑,于海麗;嚴(yán)重急性呼吸綜合征肺臟及肺外器官細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期

10 ;A complete sequence and comparative analysis of a SARS-associated virus(Isolate BJ01)[J];Chinese Science Bulletin;2003年10期

本文編號：2829393