背景:肺纖維化是一種慢性、致死性肺部疾病,是機體在多種體內(nèi)外因素作用下,導致基底膜完整性遭到一定破壞,其上皮細胞及內(nèi)皮細胞再生能力減弱,并伴隨纖維化組織增生,最終形成纖維化病灶。發(fā)病機制復雜,亦缺乏有效治療方案,預后極差。因此,進一步探索改善肺纖維化有效策略是必要的。研究表明,內(nèi)皮-間質轉化(Endothelial-mesenchymal Transition,EndMT)是各大重要器官發(fā)生纖維化機制之一。TGF-β1是調控纖維化EndMT的關鍵細胞因子。TGF-β1信號傳導通路中重要信號轉導因子為Smad蛋白,而受體抑制型蛋白中Smad7在TGF-β1信號傳導通路中起主要作用。Smad7與TGF-βI型受體結合對TGF-β1信號傳導起負調控作用。泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)可對絕大部分真核細胞內(nèi)蛋白特異性降解。Smad泛素化調節(jié)因子2(Smad Ubiquitin Regulatory Factor2,Smurf2)是泛素連接酶E3中的一種,其在TGF-β1/Smad7信號傳導通路中,主要通過泛素化降解Smad7參與纖維化發(fā)生、發(fā)展。MG132是一種與蛋白酶體結合能可逆地抑制蛋白酶體活性的醛基肽類蛋白酶體抑制劑,目前已在實驗研究領域中得到廣泛應用。研究表明,MG132能減輕心、肝、腎、皮膚等重要器官纖維化發(fā)生發(fā)展。但在肺纖維化中研究甚少,機制尚不明確。目的:通過檢測內(nèi)皮細胞表型(CD31)、間質細胞表型(α-SMA)在肺纖維化不同時間點表達情況,了解EndMT在肺纖維化中作用以及變化特點;予以蛋白酶體抑制劑MG132干預成功建立的肺纖維化大鼠模型,通過檢測CD31、α-SMA、Smurf2、TGF-β1、Smad7的表達,探討泛素蛋白酶體抑制劑MG132對肺纖維化EndMT的影響及Smurf2-Smad7信號在肺纖維化EndMT中調控機制。方法:選取96只健康雄性SD大鼠,隨機分為四組(對照組、BLM組、DMSO組、MG132組),每組24只。BLM組、DMSO組、MG132組大鼠氣管內(nèi)注入0.3ml(5mg/kg)博萊霉素溶液誘導肺纖維化動物模型;對照組大鼠氣管內(nèi)注入0.3ml生理鹽水。造模后第1天開始,MG132組大鼠每日腹腔注射0.3ml(0.1mg/kg/d)MG132溶液;BLM組每日腹腔注射0.3ml生理鹽水;DMSO組每日腹腔注射0.3ml DMSO溶媒溶液;對照組每日腹腔注射0.3ml生理鹽水。各組大鼠分別于第7、14、28天隨機處死8只,所取出肺組織用于HE染色、Masson染色、羥脯氨酸含量測定、Ashcroft評分評估大鼠肺纖維化程度;免疫組化檢測第7、14、28天大鼠Smurf2、TGF-β1、Smad7、CD31、α-SMA表達情況,RT-PCR檢測分析Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表達情況。結果:(1)大鼠一般情況:第7、14、28天,對照組大鼠一般情況佳,反應靈敏、攝食正常、活動尚可、呼吸平穩(wěn);BLM組大鼠反應逐漸遲鈍、攝食逐漸減少、活動逐漸減少、呼吸逐漸加快;DMSO組大鼠表現(xiàn)與BLM組相似;MG132組大鼠反應、攝食、活動、呼吸均介于對照組與BLM組間。第16天,MG132組大鼠死亡1只,考慮因藥物腹腔注射出現(xiàn)中腹膜炎導致死亡可能性大。(2)肺纖維化指標檢測:第7、14、28天,肺組織肺纖維化指標測定均提示,與對照組比較,BLM組大鼠肺組織纖維化指標均明顯增加(P0.05),且早期變化速率明顯高于晚期;DMSO組大鼠肺組織纖維化指標表達與BLM組大鼠相似(P0.05);MG132組大鼠肺組織纖維化指標較BLM組有所減少(P0.05),但較對照組增加(P0.05)。(3)肺組織Smurf2、TGF-β1、Smad7、CD31、α-SMA免疫組化檢測:第7、14、28天,與對照組相比,BLM組大鼠肺組織纖維化程度明顯加重,CD31表達陽性區(qū)逐漸減少,α-SMA表達陽性區(qū)漸增加,Smurf2、TGF-β1表達陽性區(qū)逐漸增加,而Smad7表達陽性區(qū)域逐漸減少(P0.05);DMSO組大鼠肺組織上述免疫組化結果與BLM組大鼠相似(P0.05);MG132組大鼠肺組織免疫組化結果介于BLM組與對照組之間(P0.05)。(4)RT-PCR檢測Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表達結果:第7、14、28天,與對照組比較,BLM組大鼠肺組織Smurf2、TGF-β1 mRNA表達顯著上調(P0.05),Smad7 mRNA表達明顯下調(P0.05);DMSO組大鼠肺組織Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表達與BLM組相似(P0.05);MG132組大鼠肺組織Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表達介于BLM組與對照組之間(P0.05)。且Smurf2 mRNA表達與大鼠肺組織纖維化程度及TGF-β1 mRNA表達呈正相關,與Smad7 mRNA表達呈負相關。結論:1、EndMT參與肺纖維化的形成,發(fā)生EndMT高峰在第14天;2、蛋白酶體抑制劑MG132參與調控大鼠肺纖維化EndMT,從而抑制肺纖維化發(fā)生發(fā)展;3、蛋白酶體抑制劑MG132可通過調節(jié)Smurf2-Smad7信號傳導,調控大鼠肺纖維化EndMT,從而抑制肺纖維化發(fā)生發(fā)展;4、Smurf2可能成為臨床防治肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的一個新靶點。
【學位單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

15圖 2-1 各組大鼠肺組織大體改變Fig.2-1 General changes of rats lung tissue in each group：① A7、A14、A28 分別表示為對照組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織；② B7、B14、B28 分別表示為 BLM 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織；③ C7、C14、C28 分別表示為 DMSO 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織；④ D7、D14、D28 分別表示為 MG132 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織。

圖 2-2 各組大鼠肺組織 HE 染色（100×）Fig.2-2 HE staining of rats lung tissue in each group（100×）：① A7、A14、A28 分別表示為對照組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 HE 染色；② B7、B14、B28 分別表示為 BLM 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 HE 染色③ C7、C14、C28 分別表示為 DMSO 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 HE 染色④ D7、D14、D28 分別表示為 MG132 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 HE 染色2.3 Masson 染色顯微鏡下表現(xiàn)① 對照組：第 7、14、28 天肺組織肺泡形態(tài)結構正常，鏡下未見明顯藍色膠原沉積，第 7、14、28 天組內(nèi)兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；② BLM 組：第 7 天肺組織肺泡形態(tài)結構有所破壞，肺泡腔可內(nèi)滲出的炎性細胞，鏡下見少量藍色纖維膠原沉積；第 14、28 天，大鼠肺組織形態(tài)結構明顯破壞鏡下見大量藍色膠原沉積；與對照組相比，藍染膠原面積明顯增加，纖維化程度明顯加重（P＜0.05），組內(nèi)兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；③ DMSO 組：第 7、14、28 天，大鼠肺組織 Masson 染色鏡下所見與 BLM 組

18圖 2-3-1 各組大鼠肺組織 Masson 染色（100×）Fig.2-3-1 Masson staining of rats lung tissue in each group（100×）注：① A7、A14、A28 分別表示為對照組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 Masson 染色② B7、B14、B28 分別表示 BLM 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 Masson 染色③ C7、C14、C28 分別表示為 DMSO 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 Masso染色；④ D7、D14、D28 分別表示為 MG132 組大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺組織 Mass染色。

【參考文獻】

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本文編號：2827827