發(fā)布時間：2020-09-02 09:44

　　 目的:急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指心源性以外各種肺內(nèi)外致病因素(嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等)導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性、頑固性呼吸衰竭。膿毒癥(sepsis)是ALI/ARDS最主要的致病因素,ALI/ARDS是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)在肺臟發(fā)生發(fā)展的惡化。ARDS的一個標(biāo)志就是肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix, ECM)的破壞,最近的研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)能夠降解ECM,可能促進(jìn)了急性肺損傷的發(fā)展。MMP-9屬于MMPs家族中的一種,被稱為Ⅳ型膠原酶(也稱明膠酶B),能夠降解基底膜成分,包括Ⅳ型膠原,纖維結(jié)合素和明膠。MMP-9活性的升高能夠大量的降解肺泡上皮細(xì)胞外基質(zhì),引起急性肺損傷的發(fā)生。 烏司他丁是從人尿中提取出來的一種蛋白酶抑制劑,具有抑制白細(xì)胞聚集、抑制白細(xì)胞釋放蛋白酶、穩(wěn)定溶酶體膜、抑制過量超氧化物的生成和清除產(chǎn)生的超氧化物、清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、減少細(xì)胞與組織損傷等藥理作用。 我們推測烏司他丁在急性炎癥打擊比如膿毒癥過程中能夠降低MMP-9的活性,從而減輕肺泡細(xì)胞外基質(zhì)的降解。在本實(shí)驗(yàn)研究中,通過對膿毒癥大鼠肺濕干重比、血清MMP-9濃度及肺臟組織MMP-9 mRNA表達(dá)水平的影響并結(jié)合肺臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化,探討烏司他丁對肺臟的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。 方法:本研究應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture, CLP)復(fù)制嚴(yán)重感染動物模型,選用雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠90只,體重在250-300g之間,分為3組:假手術(shù)組(Sham group, n=30)、鹽水組(NS group, n=30)烏司他丁組(UTI group, n=30)。假手術(shù)組只開腹,牽拉盲腸但不結(jié)扎;鹽水組行CLP后給予生理鹽水10mL/Kg體重腹腔注射;烏司他丁組行CLP后給予烏司他丁10萬U/Kg腹腔注射,濃度為1萬U/mL。每組動物按時間點(diǎn)分為5個亞組(n=6),在CLP術(shù)畢0.5h、1.5h、3h、6h和12h觀察大鼠一般情況的變化并處死動物。按時間點(diǎn)處死動物后,3h組留取右肺下葉組織,HE染色法光鏡觀察肺臟形態(tài)學(xué)改變,透射電鏡觀察肺臟的超微結(jié)構(gòu)。留取左肺組織,RT-PCR半定量測定肺組織中MMP-9 mRNA的表達(dá)。在6h動物處死后,開胸取右肺中葉,吸干表面水分,再置于85℃烤箱中24小時至恒重,稱干重,計算肺濕干重比(W/D)。通過頸總動脈插管取血2mL,離心后取上清,-80℃保存,ELISA法測定血清中MMP-9的濃度。 數(shù)據(jù)采用SPSS11.5版軟件包(SPSS Company, Chicago, Illinois, USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析,比較肺濕干重比、血清MMP-9濃度及肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)水平的變化。采用完全單因素的方差分析,方差不齊時采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)。P0.05認(rèn)為差異有顯著性,P0.01認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)上有非常顯著差異。 結(jié)果 1 CLP術(shù)后一般情況的觀察:假手術(shù)組大鼠蘇醒較早,清醒后活動基本如常,剖腹未見惡臭,腹腔水腫等表現(xiàn)。鹽水組大鼠術(shù)后均有嚴(yán)重的膿毒癥表現(xiàn):蘇醒延遲,逐漸出現(xiàn)精神萎靡,豎毛及呼吸困難等表現(xiàn),剖腹可見惡臭味血性滲液,腸管水腫,部分盲腸壞死變黑。與鹽水組大鼠相比,烏司他丁組動物臨床表現(xiàn)較輕。 2膿毒癥大鼠肺組織濕干重比(W/D)變化:與假手術(shù)組相比,CLP術(shù)后6小時鹽水組肺組織W/D比顯著增加(5.15±0.11 vs 4.54±0.16, P0.01);與鹽水組相比,CLP術(shù)后6小時烏司他丁組肺組織W/D比顯著減少(4.74±0.08 vs 5.15±0.11, P0.01)。 3肺臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化:HE染色光鏡下觀察到假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡間隔無水腫,肺泡腔清晰;鹽水組肺泡間隔增寬,肺間質(zhì)充血,水腫,肺泡腔可見大量中性粒細(xì)胞浸潤,可見不同程度的肺不張,代償性肺氣腫等;烏司他丁組改變明顯減輕但較假手術(shù)組重。電鏡下觀察假手術(shù)組細(xì)胞絨毛、線粒體、板層小體正常;鹽水組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞線粒體大部分嵴,部分膜融合或消失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,脫顆�，F(xiàn)象明顯,微絨毛數(shù)量顯著減少,板層小體排空現(xiàn)象明顯;烏司他丁組形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變與鹽水組相比均明顯減輕。 4大鼠血清MMP-9濃度檢測結(jié)果:與假手術(shù)組相比,鹽水組血清MMP-9濃度在各個時間點(diǎn)均顯著升高(0.5h: 2895.8±268.4 pg/ml vs 2090.8±282.1pg/ml, P0.01; 1.5h: 2884.7±176.9pg/ml vs 2292.4±157.0pg/ml, P0.01; 3h: 2986.7±144.5pg/ml vs 2191.4±348.8pg/ml, P0.01; 6h: 3096.3±384.9pg/ml vs 1957.3±286.5pg/ml, P0.01; 12h: 2993.1±208.2pg/ml vs 1887.5±176.1pg/ml, P0.01);與鹽水組相比,烏司他丁組血清MMP-9濃度在各個時間點(diǎn)均顯著下降(0.5h: 2428.9±166.7 pg/ml vs 2895.8±268.4 pg/ml, P0.05; 1.5h: 2437.5±375.4pg/ml vs 2884.7±176.9 pg/ml, P0.05; 3h: 2520.4±213.1pg/ml vs 2986.7±144.5 pg/ml, P0.05; 6h: 2616.4±182.5pg/ml vs 3096.3±384.9 pg/ml, P0.05; 12h: 274.9±148.7pg/ml vs 2993.1±208.2 pg/ml, P0.01);與假手術(shù)組相比,烏司他丁組血清MMP-9濃度在0.5h組、1.5h組和3h組無統(tǒng)計學(xué)差異(0.5h: 2428.9±166.7pg/ml vs 2090.8±282.1pg/ml, P0.05; 1.5h: 2437.5±375.4 pg/ml vs 2292.4±157.0pg/ml, P0.05; 3h: 2986.7±144.5 pg/ml vs 2191.4±348.8 pg/ml, P0.05),而在6h組和12h組血清MMP-9濃度顯著升高(6h: 2616.4±182.5pg/ml vs 1957.3±286.5pg/ml, P0.05; 12h: 274.9±148.7pg/ml vs 1887.5±176.0pg/ml, P0.01)。 5大鼠肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)結(jié)果:與假手術(shù)組相比,鹽水組MMP-9 mRNA表達(dá)在各個時間點(diǎn)均顯著增加(3h: 0.833±0.115 vs 0.435±0.043, P0.01; 6h: 0.883±0.034 vs 0.338±0.035, P0.01; 12h: 0.853±0.023 vs 0.253±0.032, P0.01);與鹽水組相比,烏司他丁組MMP-9 mRNA表達(dá)在各個時間點(diǎn)均顯著下降(3h: 0.610±0.080 vs 0.833±0.115, P0.05; 6h: 0.470±0.092 vs 0.883±0.034, P0.01; 12h: 0.468±0.013 vs 0.853±0.023, P0.01);與假手術(shù)組相比,烏司他丁組MMP-9 mRNA表達(dá)在各個時間點(diǎn)均顯著增加(3h: 0.610±0.080 vs 0.435±0.043, P0.05; 6h: 0.470±0.092 vs 0.338±0.035, P0.05; 12h: 0.468±0.013 vs 0.253±0.032, P0.01)。 結(jié)論 1 CLP法能夠成功復(fù)制大鼠膿毒癥模型。 2 MMP-9與炎癥反應(yīng)的程度密切相關(guān),隨著炎癥反應(yīng)的加重,其濃度不斷升高;MMP-9與肺損傷密切相關(guān),肺損傷越嚴(yán)重,MMP-9活性越高。 3烏司他丁能夠減少肺組織MMP-9 mRNA的表達(dá),降低血清MMP-9的濃度,從而減輕肺損傷,保護(hù)肺功能。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R459.7;R563.8

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本文編號：2810441