【摘要】： 研究背景肺微血管通透性增高是急性肺損傷(ALI)重要的病理特征和發(fā)病機(jī)制,這時(shí)液體和蛋白由血管腔進(jìn)入間質(zhì)間隙和肺泡,形成致命性的肺水腫和呼吸衰竭。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是ALI的嚴(yán)重階段。因此,肺微血管通透性的研究是ALI和ARDS領(lǐng)域的重要課題,了解血管通透性增高的機(jī)制至關(guān)重要。引起血管通透性增高的炎癥介質(zhì)大多數(shù)是通過(guò)改變血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白的含量、分布及功能使血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架發(fā)生變化,導(dǎo)致內(nèi)皮回縮,細(xì)胞間隙增大,內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增高。src抑制的蛋白激酶C底物(src suppressed C kinasesubstrate,SSeCKS)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞骨架蛋白,既往人們對(duì)其研究多關(guān)注于它在腫瘤發(fā)生中的作用,而對(duì)它在調(diào)控血管通透性方面的作用了解甚少。有文獻(xiàn)報(bào)道,SSeCKS也是一種炎癥反應(yīng)蛋白。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVEC)為觀察對(duì)象,用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘發(fā)炎癥反應(yīng),觀察LPS誘導(dǎo)RPMVEC后SSeCKS的表達(dá)變化。 目的研究src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RPMVEC)上的表達(dá),觀察脂多糖(LPS)對(duì)RPMVEC中SSeCKS的表達(dá)及RPMVEC單層通透性的影響,以及甲基強(qiáng)的松龍的干預(yù)作用。 方法體外培養(yǎng)RPMVEC,選用RT-PCR和Western blot方法,分別在基因和蛋白水平檢測(cè)RPMVEC是否表達(dá)SSeCKS:引入內(nèi)參半定量分析,隨與LPS孵育的時(shí)間及濃度不同,觀察RPMVEC中SSeCKS表達(dá)的變化。用針頭式濾器檢測(cè)LPS及LPS+甲基強(qiáng)的松龍干預(yù)后RPMVEC單層濾過(guò)系數(shù)(Kf)的變化。 結(jié)果1.體外成功分離培養(yǎng)出RPMVEC,并經(jīng)形態(tài)學(xué)及FITC-BSI結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)。2.用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法從RPMVEC總RNA中擴(kuò)增出SSeCKS的特異性條帶;用Western blot法在RPMVEC細(xì)胞蛋白提取液中檢測(cè)出SSeCKS的蛋白印跡條帶。3.正常情況下,RPMVEC中SSeCKS低表達(dá)。表達(dá)水平變化與LPS呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系:LPS孵育1h后,RPMVEC中SSeCKS mRNA的表達(dá)量隨LPS劑量增加而逐漸增高,SSeCKS蛋白水平的變化與mRNA水平的變化相一致;10mg/L的LPS與RPMVEC共同孵育,SSeCKS mRNA表達(dá)0.5h開(kāi)始增高,1h達(dá)峰值,之后逐漸降低,12h表達(dá)仍高于正常水平,甲基強(qiáng)的松龍干預(yù)可抑制LPS誘導(dǎo)的RPMVECSSeCKS mRNA的表達(dá)增高;SSeCKS蛋白表達(dá)0.5h開(kāi)始增高,3h達(dá)峰值,之后逐漸降低,12h表達(dá)仍高于正常水平。4.甲基強(qiáng)的松龍干預(yù)可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RPMVEC單層通透性的增高。 結(jié)論1.體外成功分離培養(yǎng)RPMVEC,并鑒定為RPMVEC。2.LPS可誘導(dǎo)RPMVEC中SSeCKS表達(dá)上調(diào),并呈劑量和時(shí)間依賴性。3.甲基強(qiáng)的松龍可降低LPS誘導(dǎo)的RPMVEC單層通透性增高,并下調(diào)SSeCKS mRNA的表達(dá),提示SSeCKS與LPS誘導(dǎo)的RPMVEC損傷有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R563.8
【圖文】：

1.RPMVEC的分離、培養(yǎng)和鑒定倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的RPMVEC，見(jiàn)細(xì)胞從組織塊游出時(shí)多為類圓形、多邊形，大小均勻，胞核清晰，胞質(zhì)豐富(見(jiàn)圖1)，生長(zhǎng)2一3周時(shí)出現(xiàn)單層匯合，呈鋪路石樣排列;有接觸抑制現(xiàn)象，即細(xì)胞完全單層匯合后停止分裂;與熒光標(biāo)記的異植物凝血素結(jié)合呈黃綠色熒光(見(jiàn)圖2)。

大小均勻，胞核清晰，胞質(zhì)豐富(見(jiàn)圖1)，生長(zhǎng)2一3周時(shí)出現(xiàn)單層匯合，呈鋪路石樣排列;有接觸抑制現(xiàn)象，即細(xì)胞完全單層匯合后停止分裂;與熒光標(biāo)記的異植物凝血素結(jié)合呈黃綠色熒光(見(jiàn)圖2)。

RPMVEC總剛A完整性的檢驗(yàn)Fig.3IdentitytheintegralityofRPMVECtotalRNA

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 孫耕耘,錢桂生,肖貞良,黃碧瓊,夏前明;炎性損傷對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞β受體的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2000年02期

2 孫耕耘,肖貞良,方傳彪;山莨菪堿對(duì)內(nèi)毒素致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架變化的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2001年02期

3 肖貞良,孫耕耘,錢桂生;肺循環(huán)灌注對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;1999年11期

4 丁自強(qiáng),李少華;體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的新方法[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;1992年03期

5 孫耕耘,毛寶齡;急性呼吸窘迫綜合征的研究進(jìn)展（現(xiàn)代呼吸系疾病系統(tǒng)講座第十一講）[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;1996年04期

6 張泓,孫耕耘;血管緊張素Ⅱ及其受體拮抗劑對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮炎性損傷效應(yīng)的影響[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2004年10期

本文編號(hào)：2804565