脂多糖對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞src抑制的蛋白激酶C底物表達的影響

發(fā)布時間：2020-08-26 02:47

【摘要】： 研究背景肺微血管通透性增高是急性肺損傷(ALI)重要的病理特征和發(fā)病機制,這時液體和蛋白由血管腔進入間質(zhì)間隙和肺泡,形成致命性的肺水腫和呼吸衰竭。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是ALI的嚴重階段。因此,肺微血管通透性的研究是ALI和ARDS領(lǐng)域的重要課題,了解血管通透性增高的機制至關(guān)重要。引起血管通透性增高的炎癥介質(zhì)大多數(shù)是通過改變血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白的含量、分布及功能使血管內(nèi)皮細胞骨架發(fā)生變化,導(dǎo)致內(nèi)皮回縮,細胞間隙增大,內(nèi)皮細胞單層通透性增高。src抑制的蛋白激酶C底物(src suppressed C kinasesubstrate,SSeCKS)是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞骨架蛋白,既往人們對其研究多關(guān)注于它在腫瘤發(fā)生中的作用,而對它在調(diào)控血管通透性方面的作用了解甚少。有文獻報道,SSeCKS也是一種炎癥反應(yīng)蛋白。本實驗以體外培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVEC)為觀察對象,用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘發(fā)炎癥反應(yīng),觀察LPS誘導(dǎo)RPMVEC后SSeCKS的表達變化。目的研究src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)在大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(RPMVEC)上的表達,觀察脂多糖(LPS)對RPMVEC中SSeCKS的表達及RPMVEC單層通透性的影響,以及甲基強的松龍的干預(yù)作用。方法體外培養(yǎng)RPMVEC,選用RT-PCR和Western blot方法,分別在基因和蛋白水平檢測RPMVEC是否表達SSeCKS:引入內(nèi)參半定量分析,隨與LPS孵育的時間及濃度不同,觀察RPMVEC中SSeCKS表達的變化。用針頭式濾器檢測LPS及LPS+甲基強的松龍干預(yù)后RPMVEC單層濾過系數(shù)(Kf)的變化。結(jié)果1.體外成功分離培養(yǎng)出RPMVEC,并經(jīng)形態(tài)學(xué)及FITC-BSI結(jié)合實驗證實。2.用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法從RPMVEC總RNA中擴增出SSeCKS的特異性條帶;用Western blot法在RPMVEC細胞蛋白提取液中檢測出SSeCKS的蛋白印跡條帶。3.正常情況下,RPMVEC中SSeCKS低表達。表達水平變化與LPS呈劑量和時間依賴關(guān)系:LPS孵育1h后,RPMVEC中SSeCKS mRNA的表達量隨LPS劑量增加而逐漸增高,SSeCKS蛋白水平的變化與mRNA水平的變化相一致;10mg/L的LPS與RPMVEC共同孵育,SSeCKS mRNA表達0.5h開始增高,1h達峰值,之后逐漸降低,12h表達仍高于正常水平,甲基強的松龍干預(yù)可抑制LPS誘導(dǎo)的RPMVECSSeCKS mRNA的表達增高;SSeCKS蛋白表達0.5h開始增高,3h達峰值,之后逐漸降低,12h表達仍高于正常水平。4.甲基強的松龍干預(yù)可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RPMVEC單層通透性的增高。結(jié)論1.體外成功分離培養(yǎng)RPMVEC,并鑒定為RPMVEC。2.LPS可誘導(dǎo)RPMVEC中SSeCKS表達上調(diào),并呈劑量和時間依賴性。3.甲基強的松龍可降低LPS誘導(dǎo)的RPMVEC單層通透性增高,并下調(diào)SSeCKS mRNA的表達,提示SSeCKS與LPS誘導(dǎo)的RPMVEC損傷有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R563.8
【圖文】：

倒置顯微鏡,大鼠,植物凝血素,單層

1.RPMVEC的分離、培養(yǎng)和鑒定倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的RPMVEC，見細胞從組織塊游出時多為類圓形、多邊形，大小均勻，胞核清晰，胞質(zhì)豐富(見圖1)，生長2一3周時出現(xiàn)單層匯合，呈鋪路石樣排列;有接觸抑制現(xiàn)象，即細胞完全單層匯合后停止分裂;與熒光標記的異植物凝血素結(jié)合呈黃綠色熒光(見圖2)。

熒光顯微鏡,大鼠,植物凝血素,單層