【摘要】：研究背景與目的： 肺纖維化特征性表現(xiàn)為進(jìn)行性細(xì)胞外基質(zhì)沉積,肺組織結(jié)構(gòu)破壞,肺功能逐步喪失。肌成纖維細(xì)胞活化是肺纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié),標(biāo)志性的高表達(dá)有α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin, SMA)的肌成纖維細(xì)胞主要通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)和原位成纖維細(xì)胞的激活與轉(zhuǎn)化兩種方式來(lái)源,因而將肌成纖維細(xì)胞作為治療靶點(diǎn),阻斷其活化過(guò)程,有望成為治療纖維化疾病的新策略。本論文也將圍繞肌成纖維細(xì)胞的活化及調(diào)控機(jī)制展開,分別從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和原位成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化兩個(gè)角度進(jìn)行研究。 研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素(inerleukin,IL)-22在諸多肺部病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用,并且可靶向作用于肺泡上皮細(xì)胞,故本研究第一部分旨在探討IL-22在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型中的變化與作用,以及對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制。 酪氨酸激酶拮抗劑AP24534對(duì)c-Abelson tyrosine kinase (c-Abl)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)-β1、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族的酪氨酸受體的活性有廣泛的抑制作用,且有證據(jù)顯示以上因子可參與肺纖維化的發(fā)生。故本研究第二部分旨在探討新型制劑AP24534在肌成纖維細(xì)胞活化中的干預(yù)作用及調(diào)控機(jī)制。 研究方法： 1)本研究第一部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用小劑量博來(lái)霉素氣管內(nèi)單次注射誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型,通過(guò)組織病理學(xué)觀察肺纖維化的程度,通過(guò)Western印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)指標(biāo)的變化,以及IL-22的表達(dá)變化；原代分離培養(yǎng)小鼠肺組織和脾臟淋巴細(xì)胞,通過(guò)流式分析技術(shù)檢測(cè)IL-22表達(dá)細(xì)胞在肺纖維化小鼠肺組織和脾臟中的水平；外源性給予人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞重組IL-22處理,采用Western印跡檢測(cè)α-SMA的表達(dá)變化,通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平；采用抗IL-22中和抗體腹腔內(nèi)注射肺纖維化小鼠,通過(guò)組織病理學(xué)觀察肺纖維化的程度,研究通過(guò)Western印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)指標(biāo)的變化,以及TGF-β和Smad2的磷酸化水平； 2)本研究的第二部分采用重組TGF-β1處理小鼠成纖維細(xì)胞系NIH/3T3細(xì)胞建立成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的體外細(xì)胞模型；給予NIH/3T3成纖維細(xì)胞AP24534預(yù)處理,再給予TGF-β1誘導(dǎo),通過(guò)Western印跡或?qū)崟r(shí)定量PCR檢測(cè)I型膠原,α-SMA, Vimentin和金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)變化；通過(guò)siRNA干擾技術(shù)阻斷c-Abl在成纖維細(xì)胞中的表達(dá),再通過(guò)同樣方法給予TGF-β1處理,檢測(cè)上述纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化；通過(guò)Western印跡或免疫熒光的方法檢測(cè)AP24534對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad通路,JNK通路和AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白及其磷酸化的水平的變化。 研究結(jié)果： 1)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠在造模后的1-8周呈現(xiàn)出進(jìn)行性的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,伴有肺組織中IL-22的水平的下降,于第3周最為顯著；肺纖維化小鼠肺部和脾臟中的表達(dá)IL-22的γδT細(xì)胞水平在第3周時(shí)明顯低于對(duì)照小鼠；體外采用重組IL-22處理A549細(xì)胞可以緩解博來(lái)霉素誘導(dǎo)的EMT,表現(xiàn)為EMT的標(biāo)志物α-SMA的過(guò)表達(dá)被抑制,同時(shí)可部分逆轉(zhuǎn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞增殖能力的下降；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用抗IL-22中和抗體腹腔注射肺纖維化小鼠,可明顯加重肺纖維化的程度：HE及Masson's三色染色顯示肺泡結(jié)構(gòu)的破壞及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的加重,Ⅰ/Ⅲ型膠原,α-SMA和金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)也增加,同時(shí)TGF-p mRNA和蛋白水平及Smad2磷酸化水平進(jìn)一步上調(diào)。 2)采用TGF-β1刺激NIH/3T3細(xì)胞能夠明顯誘導(dǎo)NIH/3T3成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,主要表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA,以及Vimentin,Ⅰ型膠原和金屬蛋白酶MMP9表達(dá)上調(diào),而給予NIH/3T3細(xì)胞AP24534預(yù)處理可以明顯抑制由TGF-β1誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,AP24534預(yù)處理能夠阻斷由TGF-β1誘導(dǎo)的c-Abl的活化,而通過(guò)基因敲除c-Abl也可阻斷由TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；以AP24534處理NIH/3T3細(xì)胞可抑制由TGF-β1誘導(dǎo)AKT, mTOR (mammalian target of rapamycin)和核糖體蛋白S6激酶(S6ribosomal protein, S6)的磷酸化,但不能抑帶Smad3的磷酸化和核轉(zhuǎn)位,以及JNK和c-Jun的磷酸化。 研究結(jié)論： 1)本研究第一部分結(jié)果提示IL-22在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中起保護(hù)作用,通過(guò)干預(yù)TGF-β/Smad通路來(lái)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程進(jìn)行調(diào)控的,提示了IL-22在肺纖維化中的治療作用； 2)AP24534能夠顯著抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的活化；c-Abl的活化在TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞活化過(guò)程中起重要作用,AP24534能夠通過(guò)抑制c-Abl的活化對(duì)纖維化過(guò)程進(jìn)行調(diào)控；AP24534能夠通過(guò)AKT/mTOR/S6通路對(duì)肌成纖維細(xì)胞的活化進(jìn)行調(diào)控,但其抗纖維化的作用不依賴于Smad通路和JNK通路,提示了AP24534在肺纖維化疾病診治中的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563.9
【圖文】：

如圖1.1所示，肺組織Masson三色染色中膠原纖維呈藍(lán)色，肺間質(zhì)大量膠原纖維沉積，以支氣管周為著,肺纖維化變化程度及趨勢(shì)與H&E染色結(jié)果一致；采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)肺組織I型膠原(Coll)和III型膠原(Colin)進(jìn)行染色可見(jiàn)膠原蛋白沉積增加，以氣管周最為顯著，對(duì)a-SMA染色發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素處理組小鼠肺組織a-SMA陽(yáng)性細(xì)胞增加，聚集為纖維增生灶，支氣管周及血管周亦有增生的a-SMA陽(yáng)性細(xì)胞，以第3周最為明顯，而對(duì)照組a-SMA僅在較大的支氣管

和支氣管、血管周細(xì)胞胞團(tuán)中，而在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的肺組織中，IL-22的表達(dá)顯著下調(diào)(圖2.2)。BLM SalineIL-22(17kD) ........ :.?fiADPH “~""“"“‘‘“ ：—1.. ‘ whip1w 3w 6w 8w 1w 3w 6w 8w★ * *1.4 ~~1.2 T ■-c\i 1 r-S T，0.8 門 mLr\ °blmzd 0.6 , nSaline0.4 (fiin0.2 r0 1w 3w 6w 8w圖2.1肺纖維化小鼠肺組織IL-22的表達(dá)(BLM:博來(lái)霉素處理組；Saline:生理鹽水對(duì)照組；*與Saline組相比P<0.05; Iw為造模后第1周；3w為造模后第3周；6w為造模后

圖3.2 IL-22表達(dá)細(xì)胞在博來(lái)霉素處理后第3周肺纖維化模型小鼠脾臟中的變化(BLM：博來(lái)霉素處理組；Saline:生理鹽水對(duì)照組；*與Saline組相比P<0.05)四、白細(xì)胞介素-22抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化如圖4.1所示，白細(xì)胞介素-22特異性受體IL-22R1表達(dá)于人和小鼠肺組織中，人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞表達(dá)IL-22R1,而人成纖維細(xì)胞系HFL1則不表達(dá)，結(jié)合Whittington HA等的研究結(jié)果[68]，提示肺泡上皮細(xì)胞是IL-22的作用祀細(xì)胞；外源性采用重組人源性IL-22(10ng/ml)剌激A549細(xì)胞后的5、10、20、30、60分鐘，懫用Western印跡檢測(cè)STAT3的活化程度，發(fā)現(xiàn)在IL-22作用下STAT3發(fā)生了a愃嶧⒂

本文編號(hào)：2802932