發(fā)布時(shí)間：2020-08-24 19:58

【摘要】： 支氣管哮喘是一種常見(jiàn)病，且近年來(lái)發(fā)病率有增長(zhǎng)趨勢(shì)。目前認(rèn)為該病是由炎性細(xì)胞引起的一種氣道慢性炎癥，此種炎癥使易感者對(duì)各種激發(fā)因子具有氣道高反應(yīng)性。研究支氣管哮喘的關(guān)鍵在于探明氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生機(jī)理。以往，有關(guān)氣道高反應(yīng)性的研究多以受體及炎性細(xì)胞為基礎(chǔ)，但尚不能完全解釋哮喘的發(fā)病機(jī)理。膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)，使人們可直接觀察細(xì)胞膜上單通道的活動(dòng)，從而為哮喘的研究在分子水平上開(kāi)辟了一個(gè)新領(lǐng)域。目前對(duì)氣管平滑肌的通道研究多集中在鉀通道上，由于其容易記錄，故研究者相對(duì)較多，而對(duì)于與興奮-收縮耦聯(lián)有密切關(guān)系的鈣離子通道的研究，由于其電導(dǎo)小，電流幅度較低，記錄難度大，研究者較少。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高對(duì)增加和維持氣道平滑肌細(xì)胞收縮力起重要作用。而細(xì)胞外鈣離子主要通過(guò)電壓依賴性鈣通道(voltage dependent caicium channel，VDCC)進(jìn)入細(xì)胞。鈣通道對(duì)調(diào)節(jié)支氣管平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)起主要作用。涉及氣管平滑肌上鈣離子通道的研究工作尚不多見(jiàn)，迄今對(duì)其全部類型、分布、通道活動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因素特性仍不甚了解，更缺乏與哮喘相關(guān)的鈣通道改變的報(bào)道。當(dāng)前急需用膜片鉗技術(shù)更深入地研究。其中包括：氣管平滑肌上存在的鈣通道的類型?支氣管舒張劑及免疫調(diào)節(jié)劑有無(wú)對(duì)抗作用?哪類支氣管舒張劑特異性較強(qiáng)?這正是本課題的研究方向，它將擴(kuò)充哮喘發(fā)病機(jī)制的傳統(tǒng)概念。為尋找新型的、具有高選擇性的抗哮喘藥物亦有應(yīng)用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)分成三個(gè)部分進(jìn)行研究。 1．哮喘與缺氧大鼠模型的制作；氣管平滑肌細(xì)胞(trachea smooth muscle cell，TSMC)急性酶分離及正常情況下L型鈣通道(L-type calcium channel，Ⅰ_(Ca-L)的記錄。 2．哮喘大鼠TSMC上的Ⅰ_(Ca-L)的記錄及免疫抑制劑對(duì)Ⅰ_(Ca-L)的作用。 實(shí)驗(yàn)中將雄性Waistar分為正常對(duì)照組、哮喘組、哮喘大鼠用火把花根片(Huobahuagen tablet，HBT)治療組及哮喘大鼠用地塞米松(dexamethasone，DXM)治療組共四組，分別給予相應(yīng)的處理，觀測(cè)大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞Ⅰ_(Ca-L)在正常時(shí)，哮喘發(fā)作時(shí)，以及給予HBT及DXM治療后的變化。 3.慢性缺氧(Chronieh即oxia，CH)大鼠TSMC上的I。。一L的記錄及溟 化異丙托對(duì)CH大鼠TSMC上的I。。一。的治療反應(yīng)情況。 實(shí)驗(yàn)中將雄性Wai star分為正常對(duì)照、缺氧組及缺氧用異丙托嗅胺處理 組共三組，分別給予相應(yīng)的處理。觀測(cè)大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞工。。一:在正常時(shí)、 缺氧時(shí)、以及缺氧后給予濱化異丙托品處理后的變化。 結(jié)果顯示: 一、TSMC的單離子通道 (一)、TSMC的分離及鑒別 取健康wistar大鼠體重30電359，以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭 處死后快速開(kāi)胸取氣管立即置于含有混合氣的HPPS的溶液中清冼，去除周圍 結(jié)締組織、血管、軟骨環(huán)、刮去內(nèi)膜。用HPSS液清冼2~3次。用1 .Omg.ml一‘ 鏈酶蛋白酶在36℃孵箱中消化15一ZOtnin，在此期間HPSS液中通95060:與5%C。: 的混合氣體。用HPSS清冼，徹底去除殘余的酶。用兩個(gè)針頭將氣管平滑肌分 離成絲狀，再用吸管反復(fù)吹打(10一20次)使細(xì)胞游離。將含細(xì)胞的液體吸入 離心管豎立約Zmin，讓未散開(kāi)的大塊組織下沉，取上部細(xì)胞懸液置于4℃冰 箱備用.將細(xì)胞懸液分裝到涂有多聚賴氨酸的小培養(yǎng)皿中，靜置30min，選用 細(xì)胞膜完整，有立體感，梭形，折光好的細(xì)胞作通道記錄。 通過(guò)倒置顯微鏡、藥物刺激及。一aCtin抗原檢測(cè)證實(shí)為TSMC。 (二)、單通道電流幅度及電導(dǎo) 細(xì)胞貼附式:玻璃微電極尖端與細(xì)胞膜緊密接觸，形成高阻封接，其阻 抗數(shù)值可達(dá)10一IOOGQ，由于阻值如此之高，故基本上可看成絕緣，其上之電 流可看成零。本實(shí)驗(yàn)選用阻抗值5G的電流予以記錄。 1)、去極化時(shí)，均見(jiàn)明顯的內(nèi)向電流活動(dòng)。電流幅度在同一鉗制電壓及刺激 脈沖下基本相同，呈時(shí)間不等的矩形方波。其幅度分布直方圖呈對(duì)稱的單峰 狀，并能很好地進(jìn)行正態(tài)分布擬合。無(wú)論開(kāi)放時(shí)程長(zhǎng)短，通道幅度基本一致。 2)、單通道內(nèi)向電流，在一定范圍內(nèi)，隨去極化程度增大而縮小。根據(jù)電流- 電壓關(guān)系變化的曲線，結(jié)果顯示該通道電導(dǎo)為24.3PS，這與文獻(xiàn)報(bào)道工。。一。的 電導(dǎo)為25PS較一致(n二16)。 (三)、通道動(dòng)力特性及鑒定 1.通道開(kāi)放時(shí)間 通道開(kāi)放時(shí)程直方圖均呈指數(shù)分布，且符合雙指數(shù)擬合。在一7OmV的鉗制 電壓及OmV的刺激脈沖下及控制載體為90蒯BaCI:時(shí)，兩個(gè)開(kāi)放時(shí)間常數(shù)下。l (open time constant short eomponen)、T。Zt(oPen time constant long component) 分別為(0.432士0.182)ms、(2.912士1 125)ms(n=12)。 2.通道關(guān)閉時(shí)間 通道開(kāi)放時(shí)程直方圖也呈指數(shù)分布。在一7OfnV的鉗制電壓及OmV的刺激脈 沖下及控制載體為90耐Bae12時(shí)，兩個(gè)關(guān)閉時(shí)間常數(shù)Te，(elose time constant short eomponent)、T eZ(elose time eonstant long co娜onent)分別為(2 008 士1 167)ms、(5.385士1.926)ms(n=12)。 3.Nifedipine的作用 對(duì)該通道有高選擇性的藥物nifedspine【‘〕去阻斷它，20一SM的nifedipine 能夠完全阻斷該通道。從而證實(shí)該通道就是工。。一
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2802777