【摘要】：研究背景:急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)因其高發(fā)病率和死亡率備受人們關(guān)注,嚴重威脅患者的生命健康。炎癥失控是ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),而巨噬細胞在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。因此,深入闡明巨噬細胞在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展中的炎癥調(diào)控機制,可為ALI/ARDS的防治提供新思路、新見解。非編碼RNA,包括長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA),微小RNA(microRNA,miRNA)等,在調(diào)控多種生理過程,包括細胞生存、分化、細胞周期和細胞遷移等過程中發(fā)揮重要作用。LncRNA是一類長度大于200個核苷酸、不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA。最近研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可作為炎癥轉(zhuǎn)錄的增強子或抑制劑,其通過與染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的RNA結(jié)合蛋白相互作用作為支架分子起作用,并以基因特異性和時間依賴性方式調(diào)節(jié)炎性轉(zhuǎn)錄的動態(tài)和表觀遺傳控制。有研究報道P50相關(guān)的環(huán)加氧酶-2外源性RNA PACER(p50-associated COX-2 extragenic RNA,lncRNA PACER)是一種新的長鏈非編碼RNA,已被發(fā)現(xiàn)可激活COX-2而密切參與炎癥反應(yīng),但具體機制尚不清楚。miRNA是一類長度為18~25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。其通過抑制靶基因翻譯或?qū)е缕浣到?從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達進行調(diào)控。研究表明,miR-124在調(diào)控炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其可通過抑制IL-6R、結(jié)合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、NF-κB p65亞基和TNFR相關(guān)因子6(TNF receptorassociated factor6,TRAF6)來調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的細胞因子產(chǎn)生,以減少IL-6產(chǎn)生,以及降低TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TACE)使TNF-α釋放減少。但miR-124在炎癥反應(yīng)中如何被調(diào)控尚不清楚,需進一步的研究。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferators activated receptorγ,PPARγ),作為一種轉(zhuǎn)錄因子,可參與調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝、炎癥和癌癥的進展。相關(guān)研究報道被配體激活的PPARγ可通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性以及相關(guān)信號通路,抑制促炎因子表達或升高抗炎因子,以及促進炎性細胞的凋亡等,進而發(fā)揮抗炎作用。因此,有學(xué)者認為PPARγ有可能成為抑制炎癥反應(yīng)的新治療靶點。但目前PPARγ的如何被調(diào)控以及抗炎機制仍未完全闡明。因此,更深入地了解PPARγ的抗炎機制將有利于治療一些炎癥性疾病�；诖�,我們旨在探索PACER、PPARγ以及miRNA在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及可能存在相互調(diào)控作用,有望為ARDS提供新的治療策略。目的:探索PACER在LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用以及對PPARγ和miR-124調(diào)控的關(guān)鍵機制。研究方法:1.研究PACER在LPS致巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的作用及機制1.1誘導(dǎo)巨噬細胞(Mφ):培養(yǎng)THP-1細胞,應(yīng)用100μM佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)處理48h,使THP-1分化成為巨噬細胞(Mφ)。1.2 Mφ經(jīng)LPS刺激,應(yīng)用Real-time PCR分析其PACER,miR-124的表達變化。1.3 THP-1轉(zhuǎn)染PACER siRNA后,用PMA誘導(dǎo)成為Mφ。應(yīng)用Real-time PCR分析PACER、miR-124;應(yīng)用Western blot檢測PPARγ蛋白表達變化。Mφ經(jīng)LPS刺激,應(yīng)用Real-time PCR分析PACER、miR-124以及TNF-α,IL-6,IL-10的表達。2.PPARγ在LPS致ALI中的作用探究2.1經(jīng)腹腔注射LPS建立小鼠肺損傷模型。經(jīng)肺組織學(xué)檢查(HE染色)觀察小鼠肺損傷情況;通過Real-time PCR分析各組小鼠肺組織中TNF-α,IL-6的表達;通過流式多因子檢測各組小鼠血清中TNF-α,IL-6的表達;經(jīng)Western blot檢測小鼠肺組織中PPARγ蛋白表達變化。2.2小鼠經(jīng)PPARγ激動劑羅格列酮(Rosiglitazone,Rosi)預(yù)處理后,再復(fù)制ALI模型。經(jīng)肺組織學(xué)檢查(HE染色)觀察各組小鼠肺損傷情況;通過Real-time PCR分析各組小鼠肺組織中TNF-α,IL-6的表達;通過流式多因子檢測各組小鼠血清中TNF-α,IL-6的表達;Western blot檢測各組PPARγ表達變化。3.PPARγ在LPS致巨噬細胞炎癥反應(yīng)中對miR-124調(diào)控作用及機制研究3.1 RAW264.7細胞分別經(jīng)不同濃度的PPARγ激動劑環(huán)格列酮(Ciglitazone,Cig),吡格列酮(Pioglitazone,Pio)和曲格列酮(Troglitazone,Tro)或DMSO處理,應(yīng)用Real-time PCR分析miR-124及其靶基因TRAF6表達變化。3.2 RAW264.7細胞用PPARγsiRNA或PPARγNC轉(zhuǎn)染后分別經(jīng)Cig、Pio、Tro處理,通過Real-time PCR分析miR-124及TRAF6的表達變化。3.3 RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染miR-124拮抗劑antagomir-124或NC后,再分別經(jīng)Cig、Pio、Tro處理,經(jīng)Real-time PCR分析TRAF6的表達變化。3.4 RAW264.7細胞用含有miR-124啟動子的熒光素酶報告載體(luc-pGL3/miR-124)和空載體(luc-pGL3/Basic)轉(zhuǎn)染,再分別經(jīng)Cig、Pio、Tro處理,進行熒光素酶活性測定。3.5通過生物信息學(xué)進行分析預(yù)測miR-124啟動子區(qū)中含有PPARγ的反應(yīng)元件(PPARγresponse element,PPRE)。構(gòu)建含miR-124啟動子PPARγ結(jié)合位點野生型和突變的型熒光素酶報告載體(luc-pGL3/miR-124-WT/Mut),轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞,然后分別經(jīng)Cig、Pio、Tro處理,進行熒光素酶活性測定。3.6 RAW264.7細胞分別經(jīng)Cig、Pio、Tro處理,通過ChIP測定以檢測PPARγ與miR-124的相互作用。3.7用miR-124拮抗劑antagomir-124或antagomir NC轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞后經(jīng)Cig、Pio、Tro處理,再LPS或PBS刺激,收集細胞上清液,用ELISA檢測TNF-α、IL-6表達水平。研究結(jié)果:1.Mφ細胞經(jīng)LPS刺激后,PACER、TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平顯著高于對照組(P0.05),而miR-124以及IL-10 mRNA的表達水平顯著降低(P0.05)。2.與NC相比,PACER siRNA組的Mφ細胞,PACER的表達水平顯著降低,而miR-124 mRNA和PPARγ蛋白的表達水平顯著升高(P0.05)。PACER siRNA組經(jīng)LPS刺激后,TNF-α、IL-6 mRNA的表達量較NC組明顯降低,而IL-10 mRNA表達則增加(P0.05)。3.與正常對照組相比,ALI模型組小鼠的肺組織中出現(xiàn)明顯充血、肺泡萎陷和肺泡壁增厚,并且肺組織及血清中炎癥因子TNF-α,IL-6表達水平均顯著升高(P0.05)。此外,模型組肺組織中PPARγ蛋白表達水平比對照組明顯降低(P0.05)。4.羅格列酮預(yù)處理小鼠可以減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織損傷:經(jīng)Rosi預(yù)處理的小鼠(LPS+Rosi組)肺組織損傷較LPS組減輕;與LPS組相比,LPS+Rosi組小鼠肺組織及血清中炎癥因子TNF-α,IL-6 mRNA相對表達量相比均明顯降低(P0.05)。5不同PPARγ激動劑(Cig,Pio,Tro)均可上調(diào)miR-124的表達,呈濃度依賴;同時下調(diào)miR-124靶基因TRAF6 mRNA的表達水平(P0.05)。6.與對照組相比,RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染PPARγsiRNA后分別給予Cig,Pio,Tro處理,miR-124相對表達量明顯降低,而TRAF6 mRNA表達則明顯上調(diào)(P0.05);且RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染antagomir-124后分別經(jīng)Cig,Pio,Tro處理,TRAF6 mRNA的相對表達量明顯升高(P0.05)。7.熒光素酶報告基因檢測顯示經(jīng)Cig,Pio,Tro處理,細胞中l(wèi)uc-pGL3/miR-124的熒光素酶活性顯著增加。細胞分別通過Cig,Pio,Tro處理后,luc-pGL3/miR-124-Mut組的熒光素酶活性顯著低于luc-pGL3/miR-124-WT組(P0.05)。ChIP測定顯示PPARγ可以直接結(jié)合miR-124啟動子中的PPRE。8.RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染antagomir-124后通過PPARγ不同激動劑(Cig,Pio,Tro)處理,再經(jīng)LPS刺激,細胞炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯升高(P0.05)。而轉(zhuǎn)染antagomir NC后,通過Cig,Pio,Tro處理,再經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細胞中,炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯降低(P0.05)。結(jié)論:1.PACER是調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子,其可能是通過調(diào)控PPARγ以及miR-124進而發(fā)揮調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用;2.PPARγ通過直接結(jié)合miR-124啟動子區(qū)域中的PPRE,增強miR-124啟動子轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)其表達,進而抑制炎癥因子的生成和釋放,發(fā)揮抗炎作用。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R563.8
【圖文】：

qPC照 處-12CR 分析 LP組未受到 L處理后，細胞24 mRNA 表PS 對細胞炎LPS 刺激處胞中的 PAC表達降低（陸軍軍醫(yī)炎癥因子、處理的細胞CER、TNFP＜0.05）。醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)PACER、胞（即 DMSF-α、IL-6。學(xué)位論文miR-124 的SO 組）相比mRNA 的表的表達影響比，Mφ 細表達水平明響。實驗結(jié)果胞通過 1μg明顯增加，果表g/mIL

誘導(dǎo)為M

2成ea測.2.02.2.2 PACER成為 Mφ 細胞al-time PCR測炎癥因子表2.3 WB 檢測過 PACER胞蛋白，使NC 組）相05）。R 對炎癥因子胞后經(jīng) Real-檢測 miR-1表達情況。*測敲低 PACsiRNA 轉(zhuǎn)染使用 WB 檢相比，敲低子及 miR-124-time PCR 檢24 的表達變P＜0.05 與對CER 后，M染 THP-1 細檢測分析 PP低 PACER 后4 表達的影響檢測 PACER變化。（C）Mφ對照組相比。φ 細胞中細胞 48h 后PARγ 蛋白表后，Mφ 細響。（A）PAC的表達。（B細胞經(jīng) LP。^P＜0.05PPARγ 蛋白后經(jīng) PMA（1表達變化。胞中的 PPACER siRNA 轉(zhuǎn)）Mφ 細胞S（1μg/mL）與 NC+LPS白表達變化100μM）誘導(dǎo)實驗結(jié)果表ARγ 蛋白的轉(zhuǎn)染 THP-1胞轉(zhuǎn)染 PACE處理 24h，組相比�；瘜�(dǎo)成為 Mφ表明，與對的表達量明對明

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本文編號：2801631