【摘要】： 研究背景 過敏性哮喘是一種以氣道慢性炎癥、氣道高反應性(AHR)、可逆性氣道阻塞和粘液高分泌為特征的氣道慢性疾病，病因復雜，發(fā)病機制尚不明確。近年來的研究顯示，Eos是哮喘發(fā)病過程中主要的炎癥細胞。過敏性哮喘發(fā)病時，抗原提呈細胞將抗原傳遞給T淋巴細胞并激活Th2細胞，后者釋放炎癥介質、細胞因子和趨化因子如白介素4(IL-4)、IL-5、Eotaxin等引起Eos在氣道的募集和活化。Eos不僅可分泌血小板活化因子、白三烯等炎癥因子，引起支氣管平滑肌痙攣、氣管微血管通透性增加、氣道粘膜水腫等反應；激活的Eos還可釋放嗜酸細胞陽離子蛋白、主堿基蛋白、嗜酸細胞神經毒素、嗜酸細胞過氧化酶等對上皮細胞產生直接而顯著的細胞毒作用，使氣道上皮細胞壞死脫落，基底層細胞暴露，神經末梢裸露，從而產生氣道高反應性。在哮喘患者的血、痰、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中均可見Eos的升高。 趨化因子是一類結構相似、分子量約為8—10KD，具有趨化功能的重要的細胞因子，通過作用于靶細胞表面的趨化因子受體發(fā)揮生物學效應。根據(jù)半胱胺酸的相鄰位置關系分為多個亞族。其中C-C亞族在氣道炎癥性疾病中有著重要的作用。Eotaxin屬于CC類趨化因子，通過唯一的受體CCR3特異的強有力的誘導嗜酸性粒細胞向特定組織遷移。其對嗜酸性粒細胞具有高度的選擇性，在趨化嗜酸性粒細胞參與哮喘氣道炎癥過程中具有重要的作用。CCR3(CC chemokine rceptor3)即CC趨化因子受體3，為一種受體蛋白，主要介導細胞對包括Eotaxin、Eotaxin-2、Eotaxin-3、RANTES、MCP-3、MCP-4以及MIP-1等多種趨化因子的反應并產生細胞遷移、活化等效應，其主要表達在嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞以及肥大細胞、TH2細胞、巨噬細胞上。Eotaxin等炎癥介質通過CCR3激活Eos，吸引大量Eos遷移到氣道，導致氣道炎癥和氣道高反應性的產生，引起哮喘的發(fā)作。因此，切斷該炎癥通路的信號傳導將抑制氣道炎癥的發(fā)生�？笴CR3抗體可與Eos表面的CCR3受體特異性結合，阻斷IL-5、Eotaxin等炎癥因子對Eos的作用，使Eos無法向氣道聚集，避免了Eos對氣道的破壞和哮喘的發(fā)病。 研究目的 1．合成CCR3細胞外區(qū)NH2端多肽并以此多肽免疫小鼠，制備鼠抗人抗CCR3抗體。 2．研究抗CCR3抗體對哮喘氣道炎癥和粘液高分泌的治療作用。 研究方法 采用多肽合成儀經“固相合成法”合成了CCR3細胞外區(qū)NH2端30個氨基酸的多肽序列為mttsldtvet fgttsyyddv gllcekadtr，并進行多肽偶聯(lián)和檢測序列。以該多肽對BALB／c小鼠進行免疫，免疫以后眼球取血測定血清效價，血清里的抗體效價要在1∶6250以上取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2／0進行融合，篩選獲得陽性克隆后產生并純化抗體。 選擇健康雄性的C57BL／6小鼠，6—8周齡，體重18—22，分為4組。哮喘模型組(Ova組)：以卵白蛋白(Ova)作為抗原進行兩次腹腔注射致敏(第0，14天)和三次霧化吸入激發(fā)(第24，25，26天)。抗CCR3抗體組(Anti—CCR3組)：Ova致敏和激發(fā)同Ova組，每次激發(fā)前腹腔注射抗CCR3抗體(PBND03，3mg／Kg)。非特異性IgG組(IgG組)：Ova致敏和激發(fā)同Ova組，每次激發(fā)前腹腔注射非特異性IgG(3mg／Kg)�？瞻讓φ战M(Saline組)：以生理鹽水代替Ova致敏和激發(fā)。末次激發(fā)48小時行肺泡灌洗，細胞計數(shù)，細胞因子檢測，肺組織病理檢查，MUC5AC基因表達檢測。 研究結果 1．人CCR3 NH2端30個氨基酸多肽的合成 采用多肽合成儀經固相合成法合成了人CCR3細胞外區(qū)NH2端30個氨基酸的多肽序列為mttsldtvet fgttsyyddv gllcedadtr，檢測序列證實為目的序列。 2．Western—Blot檢測抗CCR3抗體特異性 對雜交瘤細胞通過ELISA有限稀釋法篩選陽性克隆，取陽性克隆里的上清，通過篩選共得到7個克隆。為了確定我們所得的抗體是抗CCR3的特異性抗體，我們采用了表面有豐富的CCR3的Daudi細胞破碎液對所制備的7個陽性克隆細胞產生的抗體進行Western—Blot分析。結果發(fā)現(xiàn)其中三個克隆的抗體PBND03、PBND04、PBND05在特定的大小的位置上有明顯的顯色條帶，而其余4個克隆未見特異性條帶。 3．抗CCR3抗體的親和力檢測 取PBND03、04、05細胞打腹水，得到腹水后取腹水，從中純化單抗。對純化好的抗體進行ELISA檢測和濃度測定。結果為：PBND03親和力＞1.28×10~9，PBND04親和力≥2×10~7，PBND05親和力≥3.2×10~8：ELISA最佳工作濃度分別為：0.1μ8、5μg、0.2μg：濃度分別為3.85mg／ml、2.63mg／ml、2.31mg／ml。由于PBND03的親和力最高，該抗體進一步被用于在哮喘小鼠動物模型中研究對哮喘的治療作用。 4．抗CCR3抗體(PBND03)對BALF中炎癥細胞的影響 Ova組中的炎癥細胞總數(shù)比Saline組中的明顯增高。和Ova組相比，IgC組中的炎癥細胞總數(shù)沒有明顯的變化，而Anti—CCR3組中的炎癥細胞總數(shù)明顯降低。分類計數(shù)結果顯示，與Saline組相比較，Ova組中的Eos明顯增高。Anti—CCR3組中的Eos較Ova組明顯降低，而IgG組中的Eos與Ova組相比較卻沒有明顯變化。各組間巨噬細胞、淋巴細胞均未見有顯著性差異。 5．抗CCR3抗體(PBND03)對Ova致敏和激發(fā)后導致的哮喘小鼠氣道炎癥的影響 各組肺組織切片HE染色用來觀察哮喘小鼠的氣道炎癥浸潤情況以及抗CCR3抗體對氣道炎癥的抑制作用。Saline組：氣道上皮完整，纖毛排列整齊，杯狀細胞少見，基底層以及平滑肌層較薄，肺小血管內皮光滑，血管、氣道周圍見極少量的炎癥細胞，以巨噬細胞為主，未見到嗜酸性粒細胞。Ova組：氣道上皮細胞增生肥大，上皮不完整，纖毛排列紊亂，上皮下基底層增厚，平滑肌肥大增生，氣道和血管周圍、肺泡隔內見大量嗜酸性粒細胞浸潤。Anti—CCR3組：與Ova組相比，氣道和血管周圍炎癥明顯減低。IgG組：與Ova組相比，氣道和血管周圍炎癥未見明顯減少。 6．抗CCR3抗體(PBND03)對Ova致敏和激發(fā)后導致的粘液高分泌的影響 PAS染色發(fā)現(xiàn)：Saline組：氣道上皮完整，幾乎無杯狀細胞增生和粘液形成。Ova組：氣道上皮杯狀細胞增生肥大，并有粘液形成，上皮脫落不完整。Anti—CCR3組：與Ova組相比，氣道粘液分泌明顯減低。IgG組：與Ova組相比，粘液分泌未見明顯減少。 用粘液的儲備指數(shù)(MOR)和杯狀細胞的化生指數(shù)(HR)來定量分析氣道粘液的形成，結果發(fā)現(xiàn)Ova組與Saline組相比較MOR和HR均明顯增高�？笴CR3抗體可明顯減低Ova導致的MOR和HR增高，而非特異性IgG對Ova導致的MOR和HR增高無抑制作用。 7．抗CCR3抗體(PBND03)對Ova致敏和激發(fā)后導致氣道粘液素基因MUC5AC mRNA的表達的影響 如圖6所示，Saline組于MUC5AC位置沒有出現(xiàn)條帶，而Ova組于MUC5AC位置出現(xiàn)明顯條帶。和Ova組相比較，抗CCR3組在MUC5AC部位沒有出現(xiàn)明顯的條帶。IgG組在MUC5AC部位出現(xiàn)的條帶和Ova組相似。上述結果說明Ova致敏和激發(fā)引起了氣道粘液素基因MUC5AC mRNA的表達的增高，而抗CCR3抗體抑制了Ova導致氣道粘液素基因MUC5AC mRNA表達的增高。 8．抗CCR3抗體(PBND03)對BALF中細胞因子水平的影響 Ova組中IL-4較Saline組明顯增高，而抗CCR3組中的IL-4較Ova組明顯下降。Ova組中的IFN-γ水平和Saline組相比明顯下降，但是和Ova組相比，抗CCR3組中的IFN-γ水平沒有明顯變化。IgG組中無論是IL-4還是IFN-γ水平與Ova組相比均無明顯變化。上述結果表明，抗CCR3抗體減少了Ova所致的肺部IL-4的水平增高，而對IFN-γ水平卻沒有影響。 結論 1．本研究合成了CCR3細胞外區(qū)NH2端多肽，并以此多肽免疫小鼠成功地獲得了鼠抗人抗CCR3抗體。 2．本研究合成的鼠抗人抗CCR3抗體可顯著抑制哮喘小鼠的氣道炎癥和粘液高分泌等哮喘發(fā)病的特征性病理改變，其作用與直接阻斷炎癥細胞浸潤和對IL-4下調有關。 3．本研究結果提示阻斷CCR3通路是有效的治療哮喘的途徑，為進一步研究開發(fā)相關的哮喘治療藥物提供了實驗參考。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R562.25
【圖文】：

圖1一1:人ccR3結構示意圖OUT為包括NHZ端的細胞外區(qū)，俐為包括COOH端的細胞內區(qū)，兩條水平線之間為CCR3受體7次跨膜區(qū)。1mtt8ldtVet飽對syyddvglleekadtralmaqfrPP1ys1vftVgllgnv丫切刃rnili61k娜lrimtniyllnlaisdllfl譏lp徹ih尹堪hnWVfgh腳ekllsgfyhtglyse121iffiilltidrylaivhavfalra勝VtfgvitsiVtwglavlaalpefi勿eteelfee181tlesalypedtVys認廳hthtlrmtifclvlPllvmaieytgiiktllrePskkkykairl241ifrimavffi徹tPynvaillssyqsilfgndeerskhldIvmlvteviaysheemnPvi301yafrge幣kylth月hrhllmhlgryiPflPseklertssvsPstaepelsivf圖l一2:人CCR3序列示意圖(aeeessionoumber:U49727EMBLIGeuBank)

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本文編號：2799765