【摘要】：背景慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見、多發(fā)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,且致殘率和死亡率較高。《慢性阻塞性肺疾病全球倡議》將慢性阻塞性肺疾病定義為一種可預(yù)防、可治療的疾病,其主要特征為持續(xù)存在的且不完全可逆的進(jìn)行性氣流受限。氣道粘液高分泌是很多慢性氣道炎癥疾病加重與進(jìn)展的重要因素,MUC5AC是其中最重要的分泌型粘蛋白,研究顯示它的分泌機(jī)制與蛋白偶聯(lián)受體、酪氨酸激酶受體(tyrosine protein kinase,TPK)、非酪氨酸激酶受體等介導(dǎo)的多個(gè)信號(hào)途徑有關(guān),其中PI3K介導(dǎo)的信號(hào)通路在MUC5AC的分泌過程中起著重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是一個(gè)介導(dǎo)機(jī)體缺氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,且在低氧應(yīng)答反應(yīng)中有著關(guān)鍵的作用。研究表明,HIF-1α不僅對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞、機(jī)體的氧平衡起重要作用,HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性在調(diào)控HIF-1的表達(dá)中起關(guān)鍵限速作用,還可誘導(dǎo)活化與缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展等相關(guān)的近100多種靶基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮廣泛的效應(yīng)。有研究表明,HIF-1α與慢性阻塞性肺疾病的肺部炎癥反應(yīng)及肺血管的重塑有關(guān),HIF-1α通過上調(diào)一氧化氮合酶基因參與了肺血管的重塑,從而參與了慢阻肺的發(fā)病過程。近幾年,HIF-1α在炎癥中的作用越來越引起重視,過去的研究證實(shí):HIF-1α通過PI3K/AKT、MAPK通路等調(diào)控多種炎癥因子,影響炎癥反應(yīng)。而PI3K/AKT通路激活能夠促進(jìn)MUC5AC的表達(dá)的研究較少,因此本研究嘗試探討在慢性阻塞性肺疾病中HIF-1a對(duì)粘蛋白MUC5AC表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,及其對(duì)COPD疾病發(fā)展過程的影響。目的研究HIF-1α和MUC5AC在慢性阻塞性肺疾病患者中表達(dá)水平,探討HIF-1α對(duì)MUC5AC表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及對(duì)COPD病程進(jìn)展的影響。方法本研究收集71例肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行初步研究,其中59例為符合標(biāo)準(zhǔn)的COPD患者樣本,12例為因其他疾病在我院住院的肺功能正常者。Realtime PCR及Western blot檢測肺泡灌洗液中上皮細(xì)胞中HIF-1α、TGF-β及MUC5AC的mRNA和蛋白的表達(dá)水平,并進(jìn)一步分析HIF-1α與MUC5AC表達(dá)的相關(guān)性。以人胚肺上皮細(xì)胞為模型細(xì)胞,分別采用HIF-1α的激動(dòng)劑CoCl2和PI3K的激動(dòng)劑740Y-P進(jìn)行處理,Realtime PCR和Western blot法檢測處理后細(xì)胞HIF-1α、EGFR、AKT及MUC5AC的mRNA和蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)一步探討HIF-1α和PI3K對(duì)MUC5AC的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果1.與對(duì)照組相比,COPD組HIF-1α、TGF-β、MUC5AC的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);HIF-1α與MUC5AC的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)性。2.CoCl2成功誘導(dǎo)人胚肺上皮細(xì)胞形成缺氧模型后,Realtime PCR和Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α、EGFR、AKT及MUC5AC均表達(dá)升高,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);PI3K的激動(dòng)劑740Y-P處理人胚肺上皮細(xì)胞后,Realtime PCR和Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)激活PI3K后AKT的磷酸化水平增加,且MUC5AC的mRNA及蛋白水平均有顯著上升。而HIF-1α及EGFR的mRNA及蛋白水平也發(fā)生不同程度的上調(diào)。結(jié)論1.COPD組HIF-1α、TGF-β、MUC5AC的mRNA和蛋白水平均高于對(duì)照組,HIF-1α的mRNA表達(dá)水平與MUC5AC的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。HIF-1α、TGF-β與MUC5AC均參與慢性阻塞性肺疾病病理過程。2.CoCl2誘導(dǎo)人胚肺細(xì)胞NCI-H1563缺氧導(dǎo)致HIF-1α高表達(dá),從而上調(diào)EGFR激活PI3K致使MUC5AC表達(dá)升高;PI3K激動(dòng)劑740Y-P可以通過激活EGFR-PI3K-AKT信號(hào)通路從而使MUC5AC表達(dá)升高,同時(shí)反饋性地上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。提示HIF-1α和MUC5AC之間存在正反饋調(diào)節(jié)作用,可協(xié)同促進(jìn)炎癥反應(yīng)和粘蛋白的分泌。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563.9
【圖文】：

第二部分：HIF-1α與 MUC5AC 在 COPD 中的正反饋機(jī)制結(jié)果 不同處理組細(xì)胞 HIF-1α、EGFR 和 MUC5AC 的熒光定量結(jié)果采用 125μM CoCl2處理人胚肺上皮細(xì)胞造成的低氧應(yīng)答細(xì)胞模型，與未的對(duì)照組細(xì)胞相比 HIF-1α mRNA 表達(dá)量上調(diào)為 3.97±0.2787，EGFR mRNA量上調(diào)為 2.247±0.3253，MUC5AC mRNA 表達(dá)量上調(diào)為 3.14±0.1058，且差具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖 2、表 3。采用 20μM 740Y-P 激活 EGFR/PI3K/AKT 通路的人胚肺上皮細(xì)胞，與未的對(duì)照組細(xì)胞相比 HIF-1α mRNA 表達(dá)量上調(diào)為 2.03±0.1353，EGFR mRNA量上調(diào)為 1.48±0.28，MUC5AC mRNA 表達(dá)量上調(diào)為 2.383±0.3172，且差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖 2、表 3。

Control 1.143±0.1115 1.21±0.2254 1.16±0.2563125μM CoCl23.97±0.2787*** 2.247±0.3253*** 3.14±0.1058***740Y-P 2.03±0.1353*** 1.48±0.28*** 2.383±0.3172***注：與對(duì)照組相比，*表示 P＜0.05；**表示 P＜0.01；***表示 P＜0.0012.2 不同處理組細(xì)胞 HIF-1α、EGFR、MUC5AC 和 p-AKT 的蛋白免疫印跡結(jié)果Western blot 結(jié)果顯示在 CoCl2誘導(dǎo)的低氧應(yīng)答模型中，與未處理的對(duì)照組相比，HIF-1α、EGFR、MUC5AC 及 p-AKT 的蛋白表達(dá)水平均有顯著上調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AKT 磷酸化水平增加意味著低氧應(yīng)答機(jī)制過表達(dá)HIF-1α激活 EGFR/PI3K/AKT 通路，見圖 3。采用 20μM 740Y-P 激活 EGFR/PI3K/AKT 通路的人胚肺上皮細(xì)胞，與未處理的對(duì)照組細(xì)胞相比，AKT 磷酸化水平顯著上升，且 MUC5AC 的表達(dá)水平亦有顯著上調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；相較于對(duì)照組細(xì)胞，740Y-P 處理同樣導(dǎo)致了 HIF-1α及 EGFR 蛋白水平的上調(diào)，見圖 3。

圖 4 HIF-1α促進(jìn) COPD 發(fā)生示意圖述，本研究我們首次提出 HIF-1α的高表達(dá)是由 COPD 激 HIF-1α又通過激活 EGFR/PI3K/AKT 信號(hào)通路過表達(dá) 的 過 表 達(dá) 進(jìn) 一 步 加 劇 了 慢 阻 肺 的 病 理 狀 態(tài) 。 同/AKT 通路可以進(jìn)一步反饋刺激 HIF-1α上調(diào)，從而形成惡慢阻肺的致病機(jī)理以及相關(guān)致病因子之間的關(guān)系提供了理

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2796131