發(fā)布時間：2020-08-13 17:01

【摘要】： 研究背景與目的防御素是20世紀90年代初發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于植物、昆蟲、兩棲動物、鳥類以及哺乳動物中的一類小分子陽離子抗菌肽，分子量約4kD至5kD，它們具有廣泛的抗菌譜，參與了機體的天然免疫和獲得性免疫，對免疫細胞具有趨化作用。根據(jù)空間結(jié)構(gòu)的不同，分為α-和β-防御素兩個家族。由于防御素獨特的結(jié)構(gòu)、作用方式及其免疫調(diào)節(jié)作用，防御素家族已經(jīng)引起國際學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，它們在體內(nèi)的表達方式、生理功能、作用機理、協(xié)同作用及家族新成員的相繼發(fā)現(xiàn)等均已成為該領(lǐng)域的研究熱點。然而，目前關(guān)于防御素的生物學(xué)功能的研究大部分在體外進行，這些研究只有轉(zhuǎn)化為動物模型的體內(nèi)研究后，才能更為準確的反映防御素在人類疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 β-防御素-2是第一個被發(fā)現(xiàn)的在表皮和肺上皮細胞中呈誘導(dǎo)型表達的抗菌肽，資料表明其表達水平異�；蛏锘钚允軗p與某些呼吸系統(tǒng)疾病，如先天性肺囊性纖維化及全身性感染患者肺部感染的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這提示它可能通過對病原微生物的直接殺傷或是對炎癥過程的調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用。然而迄今為止，β-防御素-2在肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍未明了。 由于肺的解剖位置的特殊性，肺在炎癥反應(yīng)過程中的重要作用，以及防御素在肺組織的豐富表達，肺成為研究防御素作用的最重要的臟器和模型。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)功能失常，感染、膿毒癥、創(chuàng)傷都可導(dǎo)致ALI的發(fā)生，其嚴重形式即急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)死亡率高達30％-50％。隨著機械通氣的運用、監(jiān)護及營養(yǎng)條件的改善，ARDS患者的死亡率有所下降，但仍是危重病患者一個主要的死亡原因，尤其是膿毒癥所致的ARDS，如何促進和改善ALI/ARDS的預(yù)后是臨床上的研究熱點。 本文擬通過轉(zhuǎn)基因的方法，實現(xiàn)重組β-防御素-2在肺部的表達，進行相關(guān)肺損傷保護作用的研究。如何采用合適的表達系統(tǒng)，在高表達的同時充分保持抗菌肽的生物學(xué)活性已成為研究的關(guān)鍵。腺病毒載體作為廣泛應(yīng)用的表達系統(tǒng)之一，能有效感染哺乳動物細胞，具有高效傳遞和表達基因的能力，利用腺病毒載體系統(tǒng)在哺乳動物細胞內(nèi)進行抗菌肽的表達目前尚未見報道。 本文將以人β-防御素-2(hBD2)的同源體——大鼠β-防御素-2(rBD2)為研究對象，分為①構(gòu)建攜帶rBD-2基因的重組腺病毒表達載體、②重組rBD2對綠膿桿菌感染致急性肺損傷的保護作用研究、③重組rBD2對膿毒癥所致急性肺損傷的保護作用研究三個部分，探討應(yīng)用腺病毒載體系統(tǒng)獲得重組rBD2在大鼠肺部表達的可行性、了解重組rBD2在綠膿桿菌感染及膿毒癥所致急性肺損傷、肺功能障礙發(fā)生發(fā)展中的作用，以圖闡明防御素在體內(nèi)的生理功能及其作用機理，也可為研究防御素在相關(guān)疾病中的作用提供理論依據(jù)。 第一部分重組β-防御素-2基因腺病毒表達載體的構(gòu)建與真核表達 研究目的探討重組腺病毒載體在真核細胞中穩(wěn)定表達陽離子抗菌肽——β-防御素-2的可行性。 研究方法采用RT-PCR方法擴增得到大鼠β-防御素-2(rBD2)基因片段，定向插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV中，重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-rBD2轉(zhuǎn)化E．coli BJ5183-AD-1后，與腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-1發(fā)生同源重組，重組質(zhì)粒pAdEasy-rBD2轉(zhuǎn)染293細胞進行腺病毒表達載體的包裝。將包裝成功的腺病毒Ad-rBD2感染COS-7細胞，并建立SD大鼠腺病毒感染模型，進行β-防御素-2多肽的體外和體內(nèi)表達，采用Western blot與免疫組化方法檢測其表達。同法構(gòu)建對照腺病毒載體Ad-LacZ。 結(jié)果構(gòu)建的重組腺病毒表達載體含有大鼠β-防御素-2基因，滴度達到10~9PFU/ml，Western blot與免疫組化方法分別檢測到β-防御素-2在體外、體內(nèi)的表達。 結(jié)論利用腺病毒表達載體系統(tǒng)進行β-防御素-2的轉(zhuǎn)基因研究具有可行性，構(gòu)建的重組腺病毒載體在體外、體內(nèi)都能夠表達目標蛋白。 第二部分重組β-防御素-2對大鼠呼吸道綠膿桿菌感染急性肺損傷的保護作用 研究目的探討重組β-防御素-2對大鼠呼吸道綠膿桿菌感染急性肺損傷的保護作用。 研究方法清潔級健康SD雄性大鼠12只，隨機分為兩組，Ad-rBD2組(實驗組)及Ad-LacZ組(對照組)各6只。均予以氯胺酮7mg/100g腹腔注射麻醉后，行氣管插管，分別氣道滴注Ad-rBD2(10~7PFU)及Ad-LacZ(10~7PFU)。48小時后全部大鼠經(jīng)氣道滴注200μl的6×10~8CFU/ml(菌落數(shù)/毫升)綠膿桿菌ATCC27853，建立綠膿桿菌感染后肺損傷模型。氣道給予綠膿桿菌24小時后處死大鼠，采集肺泡灌洗液行肺細菌清除率測定和白細胞計數(shù)；取肺組織觀察其病理變化。 結(jié)果與對照組相比，Ad-rBD2組肺泡灌洗液白細胞計數(shù)顯著降低(P＜0.05)，細菌清除率增高(P＜0.05)，肺組織中性粒細胞和單核細胞滲出減少、肺泡結(jié)構(gòu)仍保持完整、間質(zhì)水腫減輕。 結(jié)論重組β-防御素-2具有體內(nèi)殺菌活性，對呼吸道綠膿桿菌感染大鼠肺損傷的發(fā)生、發(fā)展具有保護作用。 第三部分重組β-防御素-2對大鼠膿毒癥急性肺損傷的保護作用 研究目的探討重組β-防御素-2對大鼠膿毒癥致急性肺損傷的保護作用以及對預(yù)后的影響。 研究方法SD大鼠84只隨機分為兩組，Ad-rBD2組(實驗組)及Ad-LacZ組(對照組)各42只。均予以氯胺酮7mg/100g腹腔注射麻醉后，行氣管插管，分別氣道滴注Ad-rBD2(10~7 PFU)及Ad-LacZ(10~7 PFU)。48h后行盲腸結(jié)扎穿孔，建立膿毒癥模型。于模型完成后0h，12h，24h，36h，72h處死大鼠(每個時間點n=12，實驗組、對照組各6只)，取肺及腹腔灌洗液，行灌洗液細菌計數(shù)、肺組織常規(guī)病理切片觀察、肺組織細胞凋亡電鏡及TUNEL法檢測、肺組織ICAM-1免疫組化檢測以及大鼠生存率分析(n=24，Ad-LacZ組、Ad-rBD2組各12只)。 結(jié)果與Ad-LacZ組比較，Ad-rBD2組肺組織炎性細胞浸潤及間質(zhì)水腫程度減輕，細胞凋亡減少(P＜0.05)、ICAM-1表達下降(P＜0.05)。兩組腹腔灌洗液細菌計數(shù)無明顯差別(P＞0.05)，Ad-rBD2組生存率明顯提高(P＜0.05)。 結(jié)論重組β-防御素-2對膿毒癥所致的大鼠急性肺損傷具有保護作用，可有效改善急性肺損傷的預(yù)后；其作用機制與其對炎癥因子ICAM-1、肺組織細胞凋亡的調(diào)節(jié)相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R563.8
【圖文】：

5、質(zhì)粒:pGEM一T載體:promega公司;p一Shurtle一CM、r質(zhì)粒(PsC):穿梭載體，7.4kb，含有CMV啟動子及卡那霉素抗性的質(zhì)粒，能容受6.6kb的外源基因，購自美國stratagene公司(見圖1〔1]);pAdEasy一1質(zhì)粒:為腺病毒5型骨架質(zhì)粒，33.5kb，具有氨節(jié)青霉素抗性，含有pBR322復(fù)制起始子、重組左臂、重組右臂。El，E3基因缺失，購自美國stratagene公司;p一shuttle一cMV-LacZ質(zhì)粒(PSC一LacZ):為外源基因重組腺病毒產(chǎn)物的對照質(zhì)粒，10.6kb，購自美國stratagene公司;轉(zhuǎn)化對照質(zhì)粒:為細菌BJ5183一Ad一1作電轉(zhuǎn)化效率的對照，購自美國stratagene公司;pUC18對照質(zhì)粒:為高拷貝質(zhì)粒

的大鼠肺組織免疫組化檢測顯示rBDZ表達于呼吸道肺泡上皮細胞胞漿及胞膜，且以后者為主，而空白組及對照腺病毒Ad.LacZ感染的大鼠肺組織無陽性表達(圖7)。7、大鼠肺組織常規(guī)病理檢測:肺組織常規(guī)病理切片顯示肺泡間隔無增寬，無明顯炎癥細胞浸潤，肺泡腔無滲出，炎癥病理改變不明顯(圖8)。國6盆組月翻嘴璐染�！�，細腳腳社編r刊眼農(nóng)達的 we.terUbl硯一檢側(cè)別如叮e‘D吐搜沮.ot卜山介”目刀.2e沖r.目頗加山.翔p扮.目七.t側(cè)比口d助Odor、V側(cè)吐臼公b加‘L翻el、3:10·份20.倒dLanoZ，4:l小份20.foldco沉。勸門腸dsup周團舊加址介。mco6·7如觸扭月初比Ad，LacZc翻c.trat曰翎p側(cè)比Ia恤以眾偽 nc.一i加澆改時州比Ad，舊DZ

性表達(圖7)。7、大鼠肺組織常規(guī)病理檢測:肺組織常規(guī)病理切片顯示肺泡間隔無增寬，無明顯炎癥細胞浸潤，肺泡腔無滲出，炎癥病理改變不明顯(圖8)。國6盆組月翻嘴璐染�！�，細腳腳社編r刊眼農(nóng)達的 we.terUbl硯一檢側(cè)別如叮e‘D吐搜沮.ot卜山介”目刀.2e沖r.目頗加山.翔p扮.目七.t側(cè)比口d助Odor、V側(cè)吐臼公b加‘L翻el、3:10·份20.倒dLanoZ，4:l小份20.foldco沉。勸門腸dsup周團舊加址介。mco6·7如觸扭月初比Ad，LacZc翻c.trat曰翎p側(cè)比Ia恤以眾偽 nc.一i加澆改時州比Ad，舊DZ

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 方向明,徐笑益,陳齊興,舒強;急性肺損傷對肺組織β-防御素-2基因表達的影響[J];中華麻醉學(xué)雜志;2002年05期

本文編號：2792267