【摘要】： 支氣管哮喘(下稱哮喘)是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病病，全球發(fā)病率逐年增高。慢性氣道炎癥和氣道重建是哮喘主要特征，研究表明二者相互影響互為因果，共同導(dǎo)致氣道的高反應(yīng)性和呼吸道癥狀。深入探討氣道炎癥和重建的機(jī)制對于發(fā)現(xiàn)新的、有效的哮喘治療方法具有重要意義。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome Proliferator-activated receptorγ，，PPARγ)參與多種疾病的炎癥和重建過程，具有廣泛的抗炎、抗重建作用；但對PPARγ在哮喘氣道炎癥和重建中的作用尚缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識。本課題從體內(nèi)、體外兩方面，研究PPARγ參與哮喘氣道炎癥和重建的機(jī)制。 第一部分PPARγ在慢性哮喘小鼠氣道炎癥和重建中的作用 第一節(jié)：慢性哮喘小鼠模型的建立及PPARγ的表達(dá) 目的：觀察慢性小鼠氣道炎癥和重建的表現(xiàn)，明確PPARγ的表達(dá)和組織學(xué)定位。 方法：以卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏并激發(fā)的方法建立小鼠慢性哮喘模型。檢測BALF中細(xì)胞數(shù)和IL-4水平，病理切片觀察小鼠肺內(nèi)炎癥細(xì)胞情況、氣道管壁及平滑肌厚度、粘膜血管新生和血管管壁厚度，以及氣道旁和血管旁膠原纖維沉積情況。測定肺組織羥脯氨酸含量和對腺苷、乙酰膽堿的反應(yīng)性。免疫組化方法檢查PPARγ表達(dá)的組織學(xué)定位。結(jié)果：哮喘組小鼠煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣；BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸細(xì)胞及淋巴細(xì)胞均較對照組顯著升高；氣道上皮損傷、杯狀細(xì)胞增生明顯，粘液分泌增加；支氣管周圍大量炎癥細(xì)胞聚集；氣道旁和血管旁膠原纖維增生；氣道平滑肌層和血管壁增厚。氣道對腺苷、乙酰膽堿的反應(yīng)性增高。在哮喘小鼠的氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中有明顯的PPARγ表達(dá)。結(jié)論：OVA致敏并霧化激發(fā)能建立具有廣泛炎癥和重建表現(xiàn)的慢性哮喘小鼠模型。在哮喘肺組織內(nèi)有明顯的PPARγ表達(dá)，組織學(xué)上主要集中在氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。 第二節(jié)PPARγ調(diào)節(jié)劑對慢性哮喘小鼠氣道炎癥和重建的影響。 目的：探討PPARγ調(diào)節(jié)劑對慢性哮喘小鼠氣道炎癥和重建中的作用及其機(jī)制。 方法：以PPARγ激動劑和拮抗劑分別霧化處理哮喘小鼠，觀察小鼠的病理學(xué)變化、炎癥因子和PPARγ的表達(dá)。結(jié)果：PPARγ激動劑治療后小鼠BALF中炎癥細(xì)胞和IL-4水平，氣道和肺組織的炎癥和重建程度減輕(P＜0.01)。westernblot檢查發(fā)現(xiàn)肺組織核蛋白中PPARγ的表達(dá)增加2.7倍，而TGFβ1和eotaxin的轉(zhuǎn)錄下降65％和50％，與核內(nèi)PPARγ成負(fù)相關(guān)(r=-0.895、0.954)、。結(jié)論：PPARγ激動劑能通過提高核內(nèi)PPARγ水平，改善慢性哮喘小鼠的氣道炎癥和重建。 第二部分PPARγ在氣道上皮細(xì)胞中的作用及其機(jī)制 第一節(jié)人支氣管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和PPARγ的表達(dá)。 目的：建立人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells，hBECs)原代培養(yǎng)的方法，并觀察PPARγ的表達(dá)。方法：解剖手術(shù)切除的人支氣管標(biāo)本，以植塊法體外培養(yǎng)hBECs。以TGFβ1和IL-4聯(lián)合刺激hBECs，并以RT-PCR方法測定eotaxin和Fibronectin1(FN1)，免疫熒光法確定hBEC中PPARγ的表達(dá)。結(jié)果：應(yīng)用植塊法成功培養(yǎng)原代hBECs，每1cm葉支氣管可獲得hBECs 6～7×10~6。RT-PCR結(jié)果顯示hBECs經(jīng)TGFβ1和IL-4刺激6h后，eotaxin和FN1的轉(zhuǎn)錄分別較刺激前增強(qiáng)10倍和5.7倍(P＜0.01)。免疫熒光結(jié)果顯示，經(jīng)TGFβ1和IL-4刺激的hBECs胞漿內(nèi)有PPARγ的表達(dá)。結(jié)論：經(jīng)TGFB1和IL-4處理的hBECs能模擬在哮喘的體內(nèi)狀態(tài)，eotaxin和FN1轉(zhuǎn)錄增加，胞漿內(nèi)有PPARγ的表達(dá)。 第二節(jié)PPARγ激動劑對氣道上皮細(xì)胞功能的調(diào)控及其機(jī)制。 目的：探討PPARγ激動劑調(diào)控氣道上皮細(xì)胞功能的機(jī)制。方法：在不同時間點(diǎn)、以不同劑量的羅格列酮干預(yù)hBECs，westemblot檢測PPARγ和GRa的表達(dá)；以RT-PCR方法測定羅格列酮和布地奈德對eotaxin和FN1轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果：羅格列酮以劑量相關(guān)方式促進(jìn)PPARγ和GRa向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移(P＜0.01)，但與干預(yù)時間無關(guān)。羅格列酮和布地奈德均以劑量相關(guān)方式抑制細(xì)胞eotaxin和FN1的轉(zhuǎn)錄，且二者聯(lián)合使用的作用高于單一用藥(P＜0.01)。結(jié)論：PPARγ激動劑通過促進(jìn)PPARγ和GRa的核轉(zhuǎn)位，抑制炎癥和纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。 課題主要結(jié)論： 1．PPARγ參與慢性哮喘中的抗炎癥和抗重建過程。 2．PPARγ激動劑以劑量依賴的方式持續(xù)增強(qiáng)PPARγ的核轉(zhuǎn)位，但不影響PPARγ的轉(zhuǎn)錄。 3．在氣道上皮細(xì)胞內(nèi)，PPARγ激動劑能以劑量依賴的方式促進(jìn)GRa的核轉(zhuǎn)位，且不受時間影響。 4．PPARγ激動劑和糖皮質(zhì)激素能協(xié)同抑制氣道上皮細(xì)胞對炎癥介質(zhì)的合成。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R562.25
【圖文】：

三、兩組小鼠BALF的細(xì)胞因子變化哮喘組小鼠BAI萬上清液中IL4水平為【 (303.8土 22.5)Pg/ml]，較對照組 [(112.7士9.咖歲mll升高1.68倍，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.01，圖1一1一2)。 IIIL一 444 33350廳 *** 33300卜嚷魏瓤熱毅魏勇霸 霸介介250卜礴彝薰鬃爵魏馨暴襄翼粼』 』益益200卜嘴夔孽馨翼蘸毅鬢霎熟蘸翔 翔翻翻回150卜嘿滯鬢薰蒸蒸夔馨 lll\\\“100卜蟾巍馨蘸教】鬢熟黔鬢髓藻翼燕繆l戮巍撇】 】 5550卜灌蒸鬃藻羹夔毅摹蒸驀勤嘿瓣熬馨l(fā)翼羹鬢鬢鬢鬢孰 孰 OOOL—一一一 一對 對照組哮喘組 組圖1一1一2兩組小鼠BALF上清液中IL4含量比較*與對照組比較，尸<0.01四、氣道病理圖像分析哮喘組小鼠鏡下可見氣道周圍大量炎細(xì)胞浸潤，以嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主;氣道上皮受損，氣道壁不完整;氣道腔內(nèi)粘液分泌增多，粘膜水腫，粘膜皺褶增多;氣道和血管周圍大量膠原纖維沉積。氣道總管壁、內(nèi)壁、氣管平滑肌層均增厚;粘膜固有層和粘膜下層血管密度增加。而對照組小鼠氣道上皮細(xì)胞完整，支氣管周圍無炎癥細(xì)胞浸潤及基底膜增厚;氣道和血管周圍幾乎無明顯膠原纖維沉積;氣道管壁和平滑肌層較薄，粘膜固有層和粘膜下層血管較少。二組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(尸<0.01，表1一1一3

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本文編號：2784455