【摘要】： 前言 支氣管哮喘(BA)是最常見的呼吸道疾病，是由多種因素共同參與的氣道慢性炎癥，臨床表現(xiàn)為支氣管壁平滑肌收縮使氣道發(fā)生可逆性痙攣和狹窄，嚴(yán)重病例可導(dǎo)致呼吸衰竭和心功能不全，病死率約為1％。BA所引起的心臟損害已經(jīng)引起人們的廣泛注意。Iskandar研究發(fā)現(xiàn)成人BA持續(xù)狀態(tài)可出現(xiàn)心肌缺血性損害，甚至誘發(fā)心功能障礙；Wickelgren證實(shí)平喘藥可減輕心肌炎癥；Lovis等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重哮喘病人血漿中肌酸激酶、肌酸激酶同功酶、肌紅蛋白水平升高。因此，BA可能造成心肌損害，但機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探索。目前已有研究表明，鈣超載是心肌損害的主要發(fā)病機(jī)制之一，鈣超載可激活胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，其中以引起calpain的變化尤其重要。Calpain是一類鈣離子依賴的半胱氨酸蛋白激酶家族，包括兩種同工型結(jié)構(gòu)μ-calpain(calpainⅠ)和m-calpain(calpainⅡ)。Calpain在靜息狀態(tài)的細(xì)胞中以酶原形式(80kDa+30kDa)存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生暫時(shí)的或局部的鈣積累時(shí)，切去大亞基Ⅰ區(qū)N-末端和大部分小亞基的Ⅴ區(qū)自溶，經(jīng)剪切后的形態(tài)(76kDa+18kDa)具有催化活性。Calpain被激活后，通過蛋白酶的水解作用而參與包括細(xì)胞骨架重構(gòu)、信號(hào)傳遞、細(xì)胞周期的調(diào)整、細(xì)胞凋亡等生理和病理過程。 本實(shí)驗(yàn)研究在建立豚鼠哮喘動(dòng)物模型的條件下，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測方法，觀察在哮喘后豚鼠心肌組織中calpain表達(dá)的變化情況，并同時(shí)觀察激素治療對(duì)calpain表達(dá)的影響，對(duì)比觀察光鏡下心肌病理改變與心肌組織calpain表達(dá)變化的關(guān)系，探討calpain表達(dá)在哮喘后心肌損害中的作用機(jī)制，為臨床使用calpain抑制劑進(jìn)行疾病治療和預(yù)防提供新的理論依據(jù)。 材料和方法 1、動(dòng)物模型制作及分組 將單只豚鼠置于半封閉的容器中，于第1、4、7d分別超聲霧化吸人1％卵蛋白3min使其致敏。然后將同等條件豚鼠隨機(jī)分為三組進(jìn)行研究，每組10只。①哮喘組：第21d超聲霧化吸人2％卵蛋白5min誘喘，誘喘成功后24h取材；②激素治療組：誘喘前7d開始每只豚鼠面罩吸入普米克令舒(每日兩次，0.25 mg／次)至誘喘當(dāng)天，誘喘成功后24h取材。③正常對(duì)照組：用生理鹽水替代卵蛋白及糖皮質(zhì)激素吸入(方法同上)。 2、動(dòng)物標(biāo)本取材 取材前，以1％戊巴比妥腹腔注射麻醉，將豚鼠仰臥位固定，以無菌器械解剖，整體取出心臟，將心臟沿房室交界切成兩段，取心室段。留取的心肌組織標(biāo)本，用4％多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片。 3、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果觀察 (1)切片常規(guī)HE染色，光鏡觀察三組心肌組織標(biāo)本病理學(xué)改變。 (2)免疫組織化學(xué)染色，在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，成像后利用Motic Images Advanced 3.1圖像分析系統(tǒng)對(duì)其染色強(qiáng)度進(jìn)行分析，結(jié)果用灰度值表示，用以觀察三組心肌組織calpainⅠ、calpainⅡ的表達(dá)強(qiáng)度。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 圖像分析檢測數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±SD)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析與顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)p=0.05。 結(jié)果 1、所有實(shí)驗(yàn)組豚鼠于于第21d開始每天一次超聲霧化吸人2％卵蛋白5min誘喘，均出現(xiàn)明顯哮喘癥狀與體征，并且肺組織病理學(xué)也證實(shí)哮喘動(dòng)物模型制作成功。 2、正常組與激素治療組心肌纖維排列整齊，橫紋清楚。哮喘組可見散在灶狀心肌纖維崩解，節(jié)段性嗜伊紅染色增強(qiáng)，心肌纖維橫紋不清，偶見收縮帶狀壞死及灶狀炎細(xì)胞浸潤。 3、CalpainⅠ在各組豚鼠心肌中表達(dá)的相對(duì)含量沒有顯著差異； 4、哮喘組豚鼠心肌calpainⅡ表達(dá)含量較正常組明顯增高； 5、治療組豚鼠心肌calpainⅡ表達(dá)含量較正常組沒有顯著差異。 討論 豚鼠哮喘許多特點(diǎn)與人類相似，包括過敏反應(yīng)由IgE介導(dǎo)，激發(fā)后可發(fā)生速發(fā)相與遲發(fā)相反應(yīng)等。在本實(shí)驗(yàn)哮喘組豚鼠均出現(xiàn)明顯哮喘癥狀與體征，肺部病理學(xué)也發(fā)現(xiàn)存在支氣管平滑肌收縮，管腔狹窄，中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤等，均證明哮喘動(dòng)物模型制作成功。說明本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可靠，重復(fù)性好，為下一步研究哮喘引起心肌損害的工作打下了良好的基礎(chǔ)。 BA是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)，可產(chǎn)生缺氧和二氧化碳潴留，致使呼吸性酸中毒和代謝性酸中毒，進(jìn)一步出現(xiàn)循環(huán)衰竭。BA所引起的心臟損害已經(jīng)引起人們的廣泛注意，本實(shí)驗(yàn)哮喘組心肌HE染色證實(shí)了BA除肺部病變外，還存在心肌損傷的病理學(xué)改變。 BA引起心肌損害的機(jī)理目前尚不十分清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察表明缺氧造成的一種細(xì)胞死亡形式——凋亡，在心肌損傷中有非常關(guān)鍵性的作用。氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、ATP、ADP、AMP含量耗竭、酸中毒、NO生成等與凋亡密切相關(guān)，其中鈣超載與鈣依賴的中性蛋白酶calpain激活是調(diào)亡發(fā)生機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在豚鼠哮喘模型建立后，哮喘組豚鼠心肌calpainⅡ表達(dá)的含量較正常組和激素治療組明顯增高，而三組豚鼠心肌calpainⅠ表達(dá)的含量沒有顯著差異。提示哮喘發(fā)作導(dǎo)致的心肌缺血缺氧損害與calpainⅡ表達(dá)增加密切相關(guān)；與calpainⅠ表達(dá)沒有關(guān)系(至少在哮喘持續(xù)發(fā)病24小時(shí)內(nèi)沒有見到)。BA引起的心肌缺氧過程早期可出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酸中毒，從而使Na~+／H~+交換增強(qiáng)，繼而引起Na~+／Ca~(2+)交換增加，引起鈣內(nèi)流；缺氧還激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca~(2+)-ATP酶，使細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣釋放，引起細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)超載。Calpain的兩種同工型結(jié)構(gòu)calpainⅠ和calpainⅡ的激活所需要鈣離子的濃度不同，分別為5～50μmol／L和200～1000βmol／L。活化的calpain進(jìn)一步引起細(xì)胞損傷，它可以水解多種重要的底物蛋白，導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和活力的喪失。楊永健等通過結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈制作心肌梗死模型，術(shù)前7天使用雷米普利(ACEI)治療，觀察發(fā)現(xiàn)：左室游離壁calpainⅡ蛋白表達(dá)于心肌梗死第2天時(shí)達(dá)高峰，室間隔calpainⅠ蛋白表達(dá)在心肌梗死14天時(shí)增加，ACEI抑制calpainⅠ、calpainⅡ的上調(diào)，減少心肌梗死面積和間質(zhì)纖維化，提示calpainⅡ參與缺血心肌組織的早期損傷過程，calpainⅠ參與梗死心肌組織的晚期重塑，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。綜上所述，calpain在病理狀態(tài)下的活性增高，可能是一個(gè)理想的治療靶點(diǎn)，因此研究和開發(fā)選擇性更強(qiáng)、效果更顯著、副作用更小的calpain抑制劑以作為臨床上哮喘心肌損害的預(yù)防與治療就將有十分重要的意義。 結(jié)論 1、卵蛋白誘發(fā)的支氣管哮喘豚鼠存在心肌損傷； 2、支氣管哮喘豚鼠心肌calpainⅡ表達(dá)增加，與心肌損傷密切相關(guān)；calpainⅠ表達(dá)沒有變化(哮喘持續(xù)發(fā)病24小時(shí)內(nèi))； 3、吸入糖皮質(zhì)激素能下調(diào)calpainⅡ的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2776848