【摘要】： 目的: 關(guān)于哮喘發(fā)病機(jī)制,氣道上皮缺陷理論已成為主流觀點(diǎn)之一。哮喘的病理特征之一表現(xiàn)為支氣管上皮損傷、脫落,提示哮喘患者的氣道上皮對損傷應(yīng)激的修復(fù)反應(yīng)可能出現(xiàn)缺陷。已知上皮細(xì)胞通過表達(dá)不同類型的粘附分子實(shí)現(xiàn)“粘附”和“錨定”是發(fā)揮正常功能的先決條件。國內(nèi)外及本實(shí)驗(yàn)室多項研究證實(shí),粘附分子在氣道炎癥及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。為了確定與哮喘易感性相關(guān)的粘附分子表達(dá)特征,本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中應(yīng)用基因芯片及生物信息學(xué)方法篩選了人外周血差異表達(dá)粘附分子,發(fā)現(xiàn)連環(huán)素(catenin)家族中的CTNNAL1(catenin alpha-like 1)基因在哮喘病人中表達(dá)下調(diào)。由于目前對于CTNNAL1功能意義的直接研究極少,其在支氣管上皮及肺組織中的作用尚未見報道。本課題圍繞CTNNAL1與哮喘發(fā)病的關(guān)系、CTNNAL1對支氣管肺組織功能的影響及CTNNAL1基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了一系列研究。 方法與結(jié)果: 1) CTNNAL1與哮喘相關(guān)性分析 本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中應(yīng)用基因芯片及生物信息學(xué)方法篩選了人外周血哮喘差異表達(dá)粘附分子,結(jié)果顯示多個基因表達(dá)水平改變。本研究選擇在所有哮喘病人中均下調(diào)的CTNNAL1(catenin alpha-like1)基因,應(yīng)用熒光定量RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果的可靠性;收集正常人及哮喘病人的支氣管粘膜,并構(gòu)建經(jīng)典的OVA致敏的小鼠哮喘模型,探討CTNNAL1在支氣管肺組織的分布情況及其與哮喘的關(guān)系。 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示成年哮喘病人與正常成年人相比CTNNAL1表達(dá)水平明顯降低。哮喘兒童病人CTNNAL1表達(dá)水平似比正常兒童低,但P＞0.05,尚不能認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義,需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。 免疫組化和原位雜交顯示,CTNNAL1廣泛分布于支氣管柱狀纖毛細(xì)胞、細(xì)支氣管分泌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞。CTNNAL1在哮喘病人支氣管粘膜及哮喘模型小鼠的支氣管肺組織表達(dá)均下調(diào),哮喘模型組小鼠氣道阻力顯著高于正常組,且CTNNAL1 mRNA水平與氣道阻力呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)CTNNAL1與哮喘發(fā)病相關(guān)。 2) CTNNAL1在氣道上皮中的生物學(xué)效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)利用吸入臭氧建立Balb/c小鼠支氣管肺組織應(yīng)激損傷模型。結(jié)果顯示,臭氧應(yīng)激導(dǎo)致明顯的杯狀細(xì)胞增生和上皮缺損。原位雜交實(shí)驗(yàn)和熒光定量RT-PCR顯示臭氧應(yīng)激可上調(diào)小鼠支氣管肺組織CTNNAL1 mRNA表達(dá),于應(yīng)激的第二天達(dá)到高峰,但是隨著臭氧應(yīng)激時間的延長,CTNNAL1 mRNA表達(dá)緩慢下降。培養(yǎng)的人BEC細(xì)胞株爬片細(xì)胞原位雜交顯示,未受臭氧應(yīng)激組BEC陽性細(xì)胞數(shù)較少,胞漿呈淺黃色,臭氧攻擊培養(yǎng)的人BEC 30 min后,陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,染色明顯加深,呈深黃色。熒光定量RT-PCR結(jié)果與原位雜交一致。提示CTNNAL1參與BEC應(yīng)激反應(yīng),其表達(dá)水平受應(yīng)激調(diào)控。 為闡明CTNNAL1在急性應(yīng)激下上調(diào)的功能意義,我們利用CTNNAL1表達(dá)質(zhì)粒和CTNNAL1反義寡核苷酸(ASO)建立CTNNAL1高表達(dá)或阻抑手段,籍此觀察CTNNAL1在氣道上皮中的生物學(xué)作用。損傷修復(fù)測定采用機(jī)械損傷在融合的支氣管上皮細(xì)胞單層上造成一小面積不規(guī)則缺損,用顯微視頻分析系統(tǒng)每隔4h測量缺損面積一次,繪制時間與修復(fù)面積的直線回歸方程,直線的斜率為損傷修復(fù)指數(shù),斜率越大,損傷修復(fù)速度越快。增殖采用MTT法。結(jié)果顯示CTNNAL1可促進(jìn)細(xì)胞的損傷修復(fù)和增殖。CTNNAL1 mRNA在損傷修復(fù)邊緣的活躍細(xì)胞高表達(dá),有利于上皮細(xì)胞的修復(fù)。 我們還初步觀察了CTNNAL1在細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白(Fibronectin,Fn)激活與細(xì)胞遷移運(yùn)動有關(guān)的激酶中的作用。利用Western blot技術(shù)觀察到CTNNAL1 ASO單獨(dú)處理不影響FAK磷酸化,但CTNNAL1 ASO處理可降低Fn促FAK磷酸化效應(yīng),提示CTNNAL1在Fn促損傷修復(fù)與增殖效應(yīng)的FAK磷酸化途徑中發(fā)揮作用。 以上結(jié)果提示CTNNAL1參與維持氣道上皮的完整性,CTNNAL1表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致上皮功能缺陷及完整性破壞,從而與哮喘發(fā)病相關(guān)。我們認(rèn)為,急性應(yīng)激條件下CTNNAL1表達(dá)上調(diào)是一種保護(hù)性應(yīng)答,哮喘病人可能出現(xiàn)了這種應(yīng)答機(jī)制的缺陷。 3) CTNNAL1基因表達(dá)調(diào)控研究 為了進(jìn)一步認(rèn)識CTNNAL1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,本研究對CTNNAL1的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)譜進(jìn)行篩選。利用啟動子分析軟件PromoterScan和Transfac對CTNNAL1基因5′非編碼區(qū)進(jìn)行分析,推測啟動子所在范圍在-552～-152 from ATG。TESS軟件(Transcription ElementSearch System)分析該區(qū)域內(nèi)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),據(jù)此設(shè)計8條探針,覆蓋所有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),應(yīng)用凝膠阻滯電泳(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)篩選調(diào)控CTNNAL1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果顯示探針1,2,3,5,8有與蛋白結(jié)合形成的滯后帶,能被100倍未標(biāo)記探針?biāo)偁?為特異性結(jié)合。通過突變探針結(jié)合試驗(yàn)、抗體超遷移試驗(yàn),證實(shí)與探針結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子分別為LEF-1、AP-2α和CREB。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示,LEF-1和AP-2α可特異性與CTNNAL1啟動子結(jié)合。 緊接著,我們用基因定點(diǎn)突變技術(shù)觀察LEF-1和AP-2α對CTNNAL1啟動子活性的影響,結(jié)果顯示LEF-1與AP-2α的結(jié)合位點(diǎn)突變后,CTNNAL1啟動子活性下降。 進(jìn)一步,我們用EMSA觀察到LEF-1與AP-2α在臭氧應(yīng)激30min后的活化情況,結(jié)果顯示臭氧應(yīng)激后LEF-1活化增加,在應(yīng)激后1h達(dá)到高峰,AP-2α的活化發(fā)生在0-1h之間,于應(yīng)激后30 min達(dá)到高峰。CTNNAL1 mRNA的表達(dá)與兩種轉(zhuǎn)錄因子的激活一致。提示在臭氧應(yīng)激條件下,LEF-1與AP-2α特異性與CTNNAL1結(jié)合,共同調(diào)控CTNNAL1的表達(dá)。 結(jié)論: LEF-1與AP-2α特異性與CTNNAL1結(jié)合,共同調(diào)控CTNNAL1的表達(dá)。急性應(yīng)激條件下CTNNAL1表達(dá)上調(diào),促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)與增殖,參與維持氣道上皮的完整性。CTNNAL1在哮喘病人及哮喘模型小鼠表達(dá)下調(diào),可能導(dǎo)致上皮功能缺陷及完整性破壞,從而與哮喘發(fā)病相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 秦曉群,向陽,羅自強(qiáng),張長青,孫秀泓;纖維連接蛋白或精甘天冬氨酸肽促進(jìn)兔支氣管上皮細(xì)胞NO合成[J];生理學(xué)報;2000年06期

2 秦曉群,向陽,管茶香,張長青,孫秀泓;整合素配體結(jié)合反應(yīng)上調(diào)兔支氣管上皮細(xì)胞抗氧化能力[J];生理學(xué)報;2001年01期

3 譚宇蓉,秦曉群,管茶香,張長青,羅自強(qiáng),孫秀泓;肺內(nèi)調(diào)節(jié)肽對支氣管上皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)及NF-κB活性的調(diào)控(英文)[J];生理學(xué)報;2003年02期

4 向陽,秦曉群,管茶香,張長青,羅自強(qiáng),孫秀泓;纖維連接蛋白上調(diào)兔支氣管上皮細(xì)胞過氧化氫酶表達(dá)[J];生理學(xué)報;2004年03期

5 韓照升,徐軍,李時悅,鐘南山;支氣管哮喘患者氣道粘膜活檢組織MMP-9表達(dá)的臨床研究[J];中國實(shí)用內(nèi)科雜志;2002年06期

6 張長青,秦曉群,管茶香,向陽,孫秀泓;纖維連接蛋白對支氣管上皮細(xì)胞抗氧化損傷保護(hù)作用的研究[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2001年04期

7 潘頻華,吳鄂生,陳清蘭,尹本義,胡成平,陳瓊;連環(huán)素α、β在哮喘豚鼠模型中的表達(dá)變化[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2000年08期

8 李文俊,吳人亮,李娜萍,周晟,郝春榮,王曦;β連環(huán)素在吸煙小鼠氣道上皮損傷修復(fù)中的作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2001年08期

9 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組;支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療及教育和管理方案)[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2003年03期

10 任雁宏,秦曉群,管茶香,羅自強(qiáng),張長青,孫秀泓;氣道高反應(yīng)中血管活性腸肽及受體的時空分布[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年04期

本文編號：2775331