【摘要】：支氣管哮喘是目前嚴(yán)重威脅人類公共健康最常見的慢性肺部疾病之一,主要以反復(fù)發(fā)作性的氣急、胸悶、咳嗽等為主要臨床癥狀,常在夜間和(或)清晨發(fā)作,如果長期反復(fù)發(fā)作則可致氣道重塑導(dǎo)致氣道增厚與狹窄,最終成為阻塞性肺氣腫。目前尚未完全明確哮喘的具體發(fā)病機制,有研究表明支氣管上皮細(xì)胞的脫落和損傷參與了哮喘的病理過程,支氣管上皮細(xì)胞的凋亡為哮喘發(fā)病的起始環(huán)節(jié)。穿孔素(PFP)和顆粒酶B(GzmB)主要由細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL細(xì)胞)和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)分泌,是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因子,其在哮喘大鼠肺組織中的表達(dá)高低以及其對支氣管上皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用目前尚不明確。重組人生長激素(rhGH)為人工合成的一種多肽,其能夠通過復(fù)雜的機制抑制相應(yīng)細(xì)胞的凋亡從而達(dá)到治療目的。本實驗通過建立大鼠哮喘模型并應(yīng)用rhGH進行干預(yù),觀察PFP與GzmB的在肺組織中的表達(dá)情況、上皮細(xì)胞凋亡變化及其相互關(guān)系,以期為臨床治療哮喘提供相應(yīng)的理論依據(jù)。 目的 本實驗通過建立哮喘大鼠模型,探討哮喘大鼠支氣管上皮細(xì)胞凋亡情況、肺組織中PFP、GzmB的表達(dá)情況及rhGH的干預(yù)作用。 材料和方法 1實驗動物分組和哮喘模型制作 選取健康雄性4-6周齡SD大鼠30只,遵照隨機原則分為正常對照組、哮喘模型組和rhGH干預(yù)組,每組各10只。第1,8,15天哮喘組和干預(yù)組大鼠分別應(yīng)用新鮮調(diào)配的10%卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液1ml(其中卵清蛋白100mg,氫氧化鋁100mg)腹腔注射,致敏3次,對照組大鼠應(yīng)用生理鹽水1ml進行腹腔注射。第16d開始,分別應(yīng)用1%卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液5ml給哮喘組和干預(yù)組大鼠霧化吸入30分鐘,隔日進行1次共霧化20次；干預(yù)組各大鼠在第11次霧化吸入混懸液前30分鐘給予皮下注射rhGH(1.33KU/Kg),共注射10次；對照組大鼠每次霧化吸入生理鹽水5ml 30分鐘,隔日1次,共進行20次。 2肺組織標(biāo)本制備 最后一次霧化吸入后各組大鼠分別腹腔注射苯巴比妥100mg處死,迅速解剖取右肺置于冷凍管中并放入液氮灌中凍存,做RT-PCR用。應(yīng)用無菌生理鹽水和4%甲醛溶液對左肺進行灌注和沖洗,甲醛固定后行石蠟包埋。分別于取垂直和平行氣道兩個方向取材切片,作HE染色及TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測。 3原位細(xì)胞凋亡結(jié)果分析 于光鏡下分析結(jié)果：隨機選取5個高倍鏡野(×400并且含有同等級別支氣管)的支氣管上皮總數(shù)及陽性染色上皮細(xì)胞數(shù)(著色為棕黃色),按照公式：陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%以計算上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)。 4 RT-PCR分析 將凍存的肺組織采用Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后應(yīng)用事先設(shè)計好的引物擴增目的片段PFP、GzmB與GAPDH.進行瓊脂糖凝膠電泳后,用Band Scan 5.0凝膠分析軟件分別測定PFP、GzmB與GAPDH的灰度值,并分別以與兩者的比值作為該大鼠的代表值。 5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,多個樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關(guān)分析采用pearson相關(guān)行檢驗；以a=0.05為檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果 1病理學(xué)改變 正常對照組肺組織形態(tài)學(xué)無異常改變。哮喘模型組大鼠肺組織HE染色后可見支氣管管腔中有大小不一的粘液栓形成,支氣管上皮細(xì)胞水腫、脫落、結(jié)構(gòu)不規(guī)則；杯狀細(xì)胞增多,黏膜下層及平滑肌增厚；氣道壁及肺間質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤,以嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主；rhGH干預(yù)組炎癥反應(yīng)較哮喘組輕,杯狀細(xì)胞減少,黏膜下層及平滑肌增厚較哮喘組減輕。2上皮細(xì)胞凋亡的變化 正常對照組支氣管上皮凋亡(TUNEL原位細(xì)胞凋亡染色為棕黃色)較少；哮喘組支氣管上皮有較多凋亡,高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；應(yīng)用rhGH干預(yù)后支氣管上皮細(xì)胞凋亡高于正常對照組,但明顯低于哮喘組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3 RT-PCR結(jié)果 哮喘組和干預(yù)組的PFP及GzmB表達(dá)量均較正常對照組增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05), rhGH干預(yù)組的兩者的表達(dá)量均較哮喘組減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4相關(guān)性分析 哮喘大鼠肺組織中PFP表達(dá)量與支氣管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.800, P 0.05), GzmB表達(dá)量與支氣管上皮凋亡指數(shù)亦呈正相關(guān)(r=0.806,P0.05)。 結(jié)論 (1)PFP及GzmB通過促進支氣管上皮細(xì)胞的凋亡參與了支氣管哮喘的發(fā)生及發(fā)展過程。 (2) rhGH可通過減少PFP及GzmB的表達(dá)以緩解氣道炎癥及氣道重塑。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R562.25

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本文編號：2774945