本文關(guān)鍵詞：RIP140對(duì)膿毒癥急性肺損傷PPARγ調(diào)控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：ALI/ARDS(急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征)是臨床常見(jiàn)的危急重癥,是由各種因素導(dǎo)致彌漫性肺泡-毛細(xì)血管膜損傷,進(jìn)而引起以非心源性肺水腫和炎癥為病理特征的急性呼吸衰竭。雖然經(jīng)過(guò)幾十年的臨床和基礎(chǔ)研究,但目前尚無(wú)十分有效的針對(duì)ALI/ARDS的治療措施,其病死率依然高達(dá)40%以上[1]。因此,深入研究ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制,尋找新的有效的治療方法和新藥開(kāi)發(fā)是目前ALI/ARDS的主要研究方向。過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ(Perroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)是核受體超家族一員[2]。研究表明,PPARγ的表達(dá)或活性增強(qiáng)后可產(chǎn)生強(qiáng)力有效的抗炎作用抑制ALI/ARDS過(guò)激的炎癥反應(yīng),從而減輕病理?yè)p傷對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用,因此有學(xué)者認(rèn)為PPARγ有可能成為ALI/ARDS的一新的治療靶點(diǎn)[3~6]。但在ALI/ARDS的發(fā)病過(guò)程中通常伴隨著PPARγ的表達(dá)及活性下降,其具體調(diào)控機(jī)制不明[6,7]。受體相互作用蛋白(Receptor interacting protein 140,RIP140)是PPARγ的一轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子,對(duì)PPARγ的活性起負(fù)調(diào)控作用[8,10]。但目前仍不清楚在ALI/ARDS的發(fā)病過(guò)程中RIP140與PPARγ的相互關(guān)系以及其是否對(duì)PPARγ的表達(dá)和活性具有調(diào)節(jié)作用。因此,本研究中我們首先研究了RIP140在ALI/ARDS時(shí)肺組織中及巨噬細(xì)胞的表達(dá)變化,在此基礎(chǔ)上通過(guò)基因技術(shù)下調(diào)RIP140表達(dá)觀察對(duì)PPARγ表達(dá)和活性的影響。從輔助因子層面探討了PPARγ的上游調(diào)控機(jī)制,為PPARγ今后在ALI/ARDS的進(jìn)一步運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。目的:探討膿毒癥肺損傷時(shí)RIP140對(duì)PPARγ的調(diào)控作用,闡明在ALI/ARDS時(shí)PPARγ的上游調(diào)控機(jī)制。方法:1.膿毒癥急性肺損傷RIP140在肺組織中的表達(dá)研究通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)復(fù)制大鼠膿毒癥肺損傷模型;隨后,使用免疫組化技術(shù)、Western-blot、激光共聚焦技術(shù)觀察在膿毒癥肺損傷時(shí)RIP140在肺組織中的表達(dá)及定位。2.RIP140對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答時(shí)PPARγ表達(dá)及活性的調(diào)控研究Western-blot技術(shù)觀察在LPS刺激后RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)RIP140和PPARγ的表達(dá)變化。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建rip140shrna腺病毒載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的raw264.7巨噬細(xì)胞,使用rt-pcr、westernblot、elisa觀察在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中下調(diào)rip140的表達(dá)對(duì)pparγ表達(dá)活性及對(duì)下游炎性因子的表達(dá)影響。3.下調(diào)rip140的表達(dá)對(duì)小鼠膿毒癥急性肺損傷肺組織炎癥反應(yīng)的影響首先,通過(guò)腹腔注射lps復(fù)制小鼠膿毒癥肺損傷,westernblot檢測(cè)rip140和pparγ的表達(dá)變化規(guī)律。隨后,通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)rip140的表達(dá),westernblot檢測(cè)膿毒癥肺損傷時(shí)下調(diào)rip140對(duì)pparγ表達(dá)的影響,rt-qpcr、he染色觀察下調(diào)rip140是否通過(guò)pparγ影響肺組織炎性因子表達(dá)及病理?yè)p傷。結(jié)果:1.成功的復(fù)制了膿毒癥肺損傷動(dòng)物模型,在正常大鼠及假手術(shù)組大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞中rip140呈一較低表達(dá)水平。而clp后6h,rip140的表達(dá)水平較對(duì)照組開(kāi)始升高(p㩳0.05)至12~24h維持一較高水平(p㩳0.05)。通過(guò)激光共聚焦免疫熒光進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)rip140主要表達(dá)于胞核。2.lps刺激6h后巨噬細(xì)胞中rip140的表達(dá)較0h組開(kāi)始上升(p0.01),至12~24h維持在一較高的表達(dá)水平。在rip140表達(dá)升高的同時(shí)pparγ的表達(dá)開(kāi)始下降(p0.01)至12h其表達(dá)水平降至最低(p0.05)。通過(guò)基因技術(shù)下調(diào)rip140的表達(dá)后pparγ的表達(dá)及活性即恢復(fù),這一效應(yīng)可被pparγ阻斷劑gw9662所抑制。下調(diào)rip140的表達(dá)可明顯抑制il-1β、tnf-α、il-6mrna的表達(dá)及釋放,而這一抗炎效應(yīng)可被gw9662抑制。3.在lps刺激后6h小鼠肺組織中rip140的表達(dá)較0h,3h組開(kāi)始升高(p0.05),并持續(xù)至24h。與此相反的是,在lps刺激后6h肺組織中pparγ的表達(dá)水平較0h,3h組開(kāi)始下降(p0.05)至12~24h為此一較低的水平。通過(guò)rip140shrna腺病毒載體下調(diào)小鼠肺組織rip140表達(dá)發(fā)現(xiàn):rip140shrna+lps組小鼠肺組織中il-1β、tnf-α、il-6mrna表達(dá)水平明顯低于空載體+lps組(p0.05),但在使用pparγ阻斷劑gw9662后這些促炎基因的表達(dá)水平的明顯高rip140shrna+lps組(p0.05)。通過(guò)he染色我們進(jìn)一步證實(shí):rip140shrna+lps組小鼠肺組織病理?yè)p傷明顯低于空載體+lps組,但這一保護(hù)作用可明顯被pparγ阻斷劑gw9662逆轉(zhuǎn)結(jié)論:1.膿毒癥肺損傷時(shí)rip140在肺組織中主要表達(dá)于炎性細(xì)胞,通過(guò)體外分離培養(yǎng)膿毒癥肺損傷大鼠現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)rip140在肺泡巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平明顯升高且其主要表達(dá)于胞核;2.成功的構(gòu)建了對(duì)細(xì)胞毒性作用小轉(zhuǎn)染效率高的腺病毒載體,通過(guò)該載體攜帶的RIP140shRNA可有效下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞RIP140表達(dá);下調(diào)巨噬細(xì)胞RIP140的表達(dá)可恢復(fù)炎癥應(yīng)答過(guò)程中PPARγ的表達(dá)及活性,從細(xì)胞水平證實(shí)了RIP140對(duì)PPARγ的表達(dá)及活性存在調(diào)控作用;同時(shí)還發(fā)現(xiàn),下調(diào)巨噬細(xì)胞RIP140的表達(dá)可通過(guò)增強(qiáng)PPARγ的表達(dá)及活性,抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)及釋放。3.通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)染證實(shí):在ALI/ARDS時(shí)下調(diào)肺組織中RIP140的表達(dá)可明顯升高PPARγ的表達(dá)水平,進(jìn)而抑制肺組織中促炎基因的表達(dá)減輕肺組織病理?yè)p傷。從體內(nèi)水平證實(shí)了RIP140對(duì)PPARγ的表達(dá)及活性存在調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：受體相互作用蛋白 RIP140 膿毒癥 ALI/ARDS 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R459.7;R563.8
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 膿毒癥急性肺損傷肺組織中RIP140 表達(dá)研究14-27
• 2.1 材料與方法14-22
• 2.2 結(jié)果22-25
• 2.3 討論25-26
• 2.4 小結(jié)26-27
• 第三章 RIP140 對(duì)巨噬細(xì)胞PPARγ 表達(dá)及活性調(diào)控作用的研究27-42
• 3.1 材料與方法28-36
• 3.2 結(jié)果36-40
• 3.3 討論40-41
• 3.4 小結(jié)41-42
• 第四章 RIP140 對(duì)膿毒癥急性肺損傷肺組織炎癥反應(yīng)的影響42-51
• 4.1 材料與方法42-47
• 4.2 結(jié)果47-50
• 4.3 討論50
• 4.4 小結(jié)50-51
• 全文結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 文獻(xiàn)綜述 RIP140 與炎癥相關(guān)研究進(jìn)展57-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

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本文編號(hào)：277401