【摘要】：研究背景特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)近年來(lái)發(fā)病率和死亡率均居高不下,發(fā)病后平均生存3-5年,臨床治療效果差,激素和免疫抑制劑已經(jīng)通過(guò)循證醫(yī)學(xué)證實(shí)效果不佳1-5。目前肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)理仍不清楚,可能與肺成纖維細(xì)胞過(guò)度增生及肺泡上皮細(xì)胞凋亡失衡有關(guān),病理提示肺間質(zhì)纖維化病人存在嚴(yán)重的成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)增生,由于這些原因?qū)е路谓M織僵硬,順應(yīng)性下降,病人呼吸做功增加。要治療肺間質(zhì)纖維化,就需要減少肺部成纖維細(xì)胞增生及降解細(xì)胞外基質(zhì),恢復(fù)肺組織順應(yīng)性,目前僅有吡非尼酮(pirfenidone)和尼達(dá)尼布(nintedanib)能延緩病情發(fā)展,吡非尼酮主要作用抑制TGF-β 1對(duì)成纖維細(xì)胞肌性轉(zhuǎn)化,尼達(dá)尼布主要作用抑制成纖維細(xì)胞增生,但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)臨床效果不確切,急需新的治療方法解決特發(fā)肺間質(zhì)纖維化的治療問(wèn)題1-5,16-18。成纖維細(xì)胞具有分化為肌成纖維細(xì)胞的能力,肌成纖維細(xì)胞是一種特殊的收縮細(xì)胞,可合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM),肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts)在正常的傷口愈合中起著重要的作用。然而,在纖維化疾病中,細(xì)胞凋亡并不是正常代謝過(guò)程的一部分,這導(dǎo)致ECM的過(guò)度積累、組織功能紊亂,正常組織被瘢痕組織取代。肌成纖維細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集與肺體積的減少和癥狀的嚴(yán)重程度發(fā)展呈正相關(guān)。TGF-β 1(Tumor-transforming growth factor betal)被認(rèn)為是促進(jìn)正常傷口愈合和組織纖維化的主要介質(zhì),研究表明,Smad3是人肺成纖維細(xì)胞TGF-β 1增強(qiáng)收縮的關(guān)鍵,而通過(guò)Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的TGF-β 1誘導(dǎo)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-5mooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)也是收縮的關(guān)鍵。肌成纖維細(xì)胞以α-SMA的表達(dá)為特征,被廣泛認(rèn)為參與了這些過(guò)程,說(shuō)明了 α-SMA的表達(dá)對(duì)膠原凝膠收縮的重要性,α-SMA已被證實(shí)與成纖維細(xì)胞收縮和組織重塑有關(guān),而成纖維細(xì)胞收縮和組織重塑參與了正常傷口愈合和纖維壞死。TGF-β 1激活成纖維細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記物α-SMA和膠原蛋白分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中。TGF-β 1表達(dá)和肌成纖維細(xì)胞激活的程度與疾病進(jìn)展高度相關(guān)。拮抗TGF-β 1可顯著抑制膠原蛋白沉積和牙齦纖維化。此外,研究表明,TGF-β 1通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,不斷促進(jìn)纖維化的形成。因此,減少α-SMA和膠原蛋白的產(chǎn)生是治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的重要因素 7,9-13,15。博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化和IPF患者的纖維母細(xì)胞中Fas表達(dá)減少,與HDAC2(histone deacetylase 2)和 HDAC4(histone deacetylase 4)的表達(dá)增加有關(guān)。IPF患者的纖維母細(xì)胞有抗凋亡的現(xiàn)象,特別是Fas所介導(dǎo)的凋亡。組蛋白修飾在纖維母細(xì)胞抗凋亡中起著至關(guān)重要的作用15,TGF-β 1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化是依賴于HDAC4激活的AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,曲古霉素 A(trichostatin A,TSA)、辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoy-lanilide hydroxamic acid,SAHA)、spA(Spiruchostatin A)能抑制 TGF-β1所誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的分化,最終使α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表達(dá)和可溶型膠原蛋白的釋放減少,同時(shí)TSA能使AKT去磷酸化19。TGF-β 1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化產(chǎn)生大量膠原和纖連蛋白,導(dǎo)致ECM的積累,從而通過(guò)刺激肌成纖維細(xì)胞分化誘導(dǎo)氣道重構(gòu)。研究中,逆轉(zhuǎn)了 TGF-β1對(duì)RNA和蛋白表達(dá)水平的影響。組蛋白乙�；�(histone acetyltransferases,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDAC)的平衡通過(guò)修飾核心組蛋白或非組蛋白前體來(lái)調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞功能。與高乙�；M蛋白相關(guān)的DNA區(qū)域通常被積極轉(zhuǎn)錄。HDACs使組蛋白去乙酰化產(chǎn)生致密的染色質(zhì),不利于轉(zhuǎn)錄。非組蛋白乙酰化可影響其穩(wěn)定性、蛋白-蛋白相互作用、定位或DNA結(jié)合能力。HDACs已被證明參與各種器官的ECM生產(chǎn)。在小鼠中,與HDAC2相關(guān)的核蛋白Hop過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致心臟間質(zhì)纖維化,而HDAC抑制劑可逆轉(zhuǎn)這種纖維化。研究發(fā)現(xiàn),IPF患者肺內(nèi)的環(huán)氧化酶(cyclooxygenase 2,COX-2)表達(dá)減少,HDAC可能通過(guò)引起組蛋白去乙酰化減少COX-2的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),HDAC可能通過(guò)組蛋白去乙�；疐-IPF中的IP-10表達(dá)下降19。之前的研究中表明,HDAC2在TGF-β 1誘導(dǎo)的鼻息肉成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加,通過(guò)抑制鼻息肉器官培養(yǎng)中HDAC2等表達(dá)以及組蛋白的高乙酰化作用,抑制了 TGF-β 1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化和ECM的產(chǎn)生7-11,13-14。表觀基因?qū)W研究的證據(jù)表明,組蛋白去乙酰化酶(HDACs)的激活是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞增殖所必需的。組蛋白乙酰化時(shí),染色體打開容許轉(zhuǎn)錄因子及mRNA合成酶結(jié)合到轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)增加轉(zhuǎn)錄和表達(dá),相反組蛋白去乙�；瘯r(shí),染色體恢復(fù)緊密狀態(tài),減少基因轉(zhuǎn)錄。HDACs是一組酶,催化組蛋白和一些與細(xì)胞增殖相關(guān)的非組蛋白(如酪氨酸激酶和轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3))中賴氨酸殘基去乙酰化。在哺乳動(dòng)物中,有18個(gè)HDAC,它們被分成四類。第Ⅰ類HDACs包括HDAC1、2、3、8;第 Ⅱ 類 HDACs 包括 HDAC4、5、6、7、9、10;第Ⅲ類 HDACs 稱為 sirtuins;第四類HDAC是HDAC11。在HDACs中,HDAC1和HDAC2被報(bào)道需要胚胎干細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞的器官發(fā)育和增殖。HDAC抑制劑,如trichostatin A(TSA),可以抑制Ⅰ類和Ⅱ類HDACs的活性,并有效地抑制細(xì)胞周期進(jìn)展以及多種細(xì)胞類型的細(xì)胞增殖。最近的研究表明,SK-7041是Ⅰ類HDACs的選擇性抑制劑,其抗增殖作用與Ⅰ/Ⅱ類HDAC抑制劑相似,這表明Ⅰ類HDACs在纖維化的進(jìn)展中起主導(dǎo)作用。目前去乙�；窰DAC在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究應(yīng)用較多,尤其是在腫瘤和纖維化方面包括肺間質(zhì)纖維化,心肌纖維化,肝纖維化和腎小球纖維化方面應(yīng)用較多。并且有研究表明,幾乎所有Ⅰ類和Ⅱ類HDAC酶在IPF肺組織中均有過(guò)表達(dá)和上調(diào)19,20。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用siRNA基因沉默法在正常肺成纖維細(xì)胞沉默HDAC2 mRNA,其行為表現(xiàn)為金屬基質(zhì)酶增加,增生下降6。然而,目前仍缺乏HDAC2在人肺成纖維細(xì)胞中功能調(diào)節(jié)作用的研究。在人肺成纖維細(xì)胞增生及肌性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,HDAC2細(xì)胞表達(dá)水平如何變化?應(yīng)用基因沉默法沉默HDAC2,是否會(huì)可能改變肺成纖維細(xì)胞功能?以上都是本課題研究的目的。組蛋白去乙�；�2在肺成纖維細(xì)胞中功能調(diào)節(jié)的作用研究目的:1.明確人肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)成功。2.確定TGF-β 1刺激人肺成纖維細(xì)胞后,應(yīng)用Western blot法測(cè)定HDAC2和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)量情況。3.使用Endofectin-Max向人肺成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染小干擾RNA,確定HDAC2 siRNA特異性轉(zhuǎn)染人肺成纖維細(xì)胞是否能沉默HDAC2。4.探究組蛋白去乙�；�2(HDAC2)對(duì)人肺成纖維細(xì)胞活化增殖的影響作用。研究方法標(biāo)本來(lái)源:取胸外科手術(shù)過(guò)程中周邊正常肺組織體積約20mm*20mm,60歲男性,肺內(nèi)小結(jié)節(jié)手術(shù)病人,既往無(wú)慢性病史,吸煙史20年,吸煙指數(shù)400,無(wú)工業(yè)毒物接觸史,(活檢標(biāo)本保存于無(wú)血清DMEM冰敷或4℃),收集標(biāo)本進(jìn)行原代人肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)步驟:第2～4代人肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),應(yīng)用TGF-β 1進(jìn)行刺激48小時(shí),應(yīng)用Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)HDAC2及α-SMA表達(dá)量;繼續(xù)實(shí)驗(yàn),使用Endofectin-Max向人肺成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染小干擾RNA HDAC2(siRNA-HDAC2)24小時(shí)后,應(yīng)用Western blot法測(cè)定HDAC2的表達(dá)情況;應(yīng)用HDAC2 siRNA特異性轉(zhuǎn)染人肺成纖維細(xì)胞后,2組細(xì)胞分別傳代培養(yǎng)24小時(shí),再次應(yīng)用不同濃度TGF-β 1進(jìn)行刺激細(xì)胞48小時(shí),應(yīng)用Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)α-SMA表達(dá)量。觀察HDAC2對(duì)人肺成纖維細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:1.自行培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞,經(jīng)波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)波形蛋白(Vimentin)染色可見視野內(nèi)細(xì)胞幾乎均呈陽(yáng)性表達(dá)。本研究采用成人周邊正常肺組織塊貼壁法培養(yǎng)肺組織成纖維細(xì)胞,經(jīng)鑒定細(xì)胞原代培養(yǎng)成功(見附圖1)。2.a-SMA是肌成纖維細(xì)胞分化的標(biāo)志,應(yīng)用TGF-β 1刺激人肺成纖維細(xì)胞后,應(yīng)用Western blot法測(cè)定HDAC2和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)量均明顯增加,從圖2可以看出,對(duì)照組HDAC2細(xì)胞表達(dá)水平較低(Mean=1),TGF-β 1組HDAC2細(xì)胞表達(dá)水平較高(Mean=1.74519),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);從圖3可以看出,對(duì)照組α-SMA細(xì)胞表達(dá)水平較低(Mean=1),TGF-β 1組α-SMA細(xì)胞表達(dá)水平較高(Mean=3.17678),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.轉(zhuǎn)染人肺成纖維細(xì)胞siRNA-HDAC2組HDAC2和α-SMA的蛋白表達(dá)明顯下降從圖4可以看出,對(duì)照組HDAC2細(xì)胞表達(dá)水平較高(Mean=1),HDAC2 siRNA組HDAC2細(xì)胞表達(dá)水平較低(Mean=0.438732),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。從圖5可以看出對(duì)照組α-SMA細(xì)胞表達(dá)水平較高,對(duì)照組α-SMA表達(dá)水平分別為TGF-β 1 濃度 Omol/L 組(Mean=1)、TGF-β 1 濃度 50mol/L 組(Mean=1.95305)、TGF-β 1 濃度 100mol/L 組(Mean=2.47244);HDAC2 siRNA 組α-SMA 細(xì)胞表達(dá)水平較低,對(duì)照組α-SMA表達(dá)水平分別為TGF-β 1濃度Omol/L組(Mean=0.788312)、TGF-β 1 濃度 50mol/L 組(Mean=1.46341)、TGF-β 1 濃度100mol/L 組(Mean=2.14431);差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.通過(guò)以上研究,證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNA-HDAC2明顯抑制人肺成纖維細(xì)胞的增殖活性(具體圖示見附圖)。結(jié)論:人肺成纖維細(xì)胞存在HDAC2表達(dá)增加,應(yīng)用靶向基因沉默法沉默HDAC2,可明顯減少α-SMA表達(dá),兩者成正相關(guān)關(guān)系,HDAC2、α-SMA表達(dá)與肺成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)增生有著密切關(guān)系,提示HDAC2表達(dá)增加參與了肺成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)增生的發(fā)病機(jī)制,表明靶向沉默HDAC2可抑制人肺成纖維細(xì)胞活化增殖,提示其在特發(fā)性肺纖維化中可能發(fā)揮調(diào)控作用,進(jìn)一步深入研究,可為臨床治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化提供新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R563
【圖文】：

圖１波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）染色可見視野內(nèi)細(xì)胞幾乎均呈陽(yáng)性表達(dá)。本研[偛捎貿(mào)懾義先酥鼙噠７巫櫓樘詵ㄅ嘌巫櫓上宋赴�，经鉴定细胞原代培养硶瘭。辶x

本文編號(hào)：2773522