【摘要】： 結(jié)核病(tuberculosis,TB)是結(jié)核分枝桿菌所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。全球有1/3的人感染過結(jié)核(MTB),每年有800萬新感染患者和300萬患者死亡,表明TB仍是影響全球人類健康的一個(gè)嚴(yán)重傳染病。然而目前結(jié)核的診斷技術(shù)不夠理想,尋找快速、簡便、靈敏度和特異度高的結(jié)核桿菌的檢測方法,對結(jié)核病的預(yù)防和控制有著重大的意義。 表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)是近些年來建立的篩選血清標(biāo)志蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,具有高通量及高靈敏度,目前已用于多種腫瘤標(biāo)志物檢測的研究。本研究前期工作已經(jīng)從肺結(jié)核患者和正常人血清中篩選出6個(gè)最具有診斷意義的肺結(jié)核血清標(biāo)志蛋白。利用這6個(gè)標(biāo)志蛋白建立診斷模型,區(qū)分TB與正常對照的分類準(zhǔn)確率98.33%,靈敏度96.67%,特異度100%,陽性預(yù)測值100%,陰性預(yù)測值96.77。但由于SELDI技術(shù)尚不能直接鑒定出標(biāo)志蛋白的序列,只能得出其分子量信息。因此,本研究目的是應(yīng)用各種技術(shù)分離鑒定這些肺結(jié)核血清標(biāo)志蛋白。 目的: 1、通過改進(jìn)樣品處理、電泳條件、染色方法等,提高小分子蛋白(10kD)在一維SDS-PAGE上的分辨率,以達(dá)到質(zhì)譜鑒定的要求。 2、應(yīng)用1D-SDS-PAGE電泳、切膠酶解和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)方法進(jìn)一步分離、鑒定前期SELDI已篩選出來具有診斷價(jià)值的結(jié)核標(biāo)志蛋白,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 方法: 1、分別應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法、乙腈沉淀法、Albumin/IgG Removal試劑盒去除血清中的中高豐度蛋白,再分別進(jìn)行電泳、蛋白濃度測定,觀察白蛋白的去除情況和目的蛋白的保留情況。 2、分別比較SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、4%-12% Bis-tris NuPAGE三種一維凝膠電泳(1D-PAGE)體系對處理過的血清樣品中小分子蛋白的分離效果,以及分離膠加入尿素、甘油,電壓,染色方法等電泳條件的優(yōu)化。 3、通過一維凝膠電泳發(fā)現(xiàn)、分離肺結(jié)核相關(guān)血清小分子標(biāo)志蛋白,經(jīng)切膠酶解和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定目標(biāo)蛋白,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 結(jié)果: 1、三種方法比較,乙腈沉淀法能在去除血清95%左右的高中豐度蛋白的同時(shí)收獲更多的15kD以下的小分子量蛋白;等電點(diǎn)沉淀法和Albumin/IgG Removal試劑盒法都能去除血清大部分高豐度蛋白,使部分小分子蛋白得以顯現(xiàn),后者能很特異地只去除占血清中蛋白總量75%以上的白蛋白和免疫球蛋白。 2. Tricine-SDS-PAGE能很好地分離血清中的小分子蛋白,20kD以下的蛋白條帶清晰可見;分離膠中加入甘油或尿素能改善小分子蛋白的分離效果;銀染的靈敏度遠(yuǎn)高于膠體考染和常規(guī)考染,但在本實(shí)驗(yàn)中并沒有發(fā)現(xiàn)新的條帶。 3、應(yīng)用Tricine-SDS-PAGE電泳、切膠酶解和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)鑒定出分子量為8778Da結(jié)核標(biāo)志蛋白很可能為Apolipoprotein A-II,序列覆蓋率為21%,有3個(gè)不重復(fù)的肽段得到鑒定,結(jié)果較為可靠。 4、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),載脂蛋白AⅡ是一個(gè)分泌蛋白,它的一條氨基酸鏈含有77個(gè)(或76個(gè))氨基酸, MW=8707.9Da(或MW=8579.78),pI=5.05,可能與目的蛋白8778 Da的氨基酸序列相同。結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展與脂質(zhì)代謝方式密切相關(guān), ApoA-II又與脂質(zhì)代謝密不可分,ApoA-II可能為結(jié)核比較特異的標(biāo)志物。 結(jié)論: 1、乙腈沉淀法能在去除血清絕大部分高中豐度蛋白的同時(shí)收獲更多的15kD以下的小分子量蛋白,適合于分離血清15kD以下的蛋白。 2、Tricine-SDS-PAGE在分離20kD以下的小分子蛋白具有優(yōu)勢,應(yīng)用常規(guī)考染簡便,且與質(zhì)譜兼容較好。 3、質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,通過單向SDS-PAGE電泳分離出蛋白,切膠回收、酶解,最后用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜鑒定目的蛋白這一套技術(shù)路線可用于血清小分子低豐度蛋白的分離鑒定。 4、Apo A-II很可能是肺結(jié)核相關(guān)的血清標(biāo)志物。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R521
【圖文】：

圖 1-2 不同 pH 醋酸鈉緩沖液處理血清后上清中蛋白含量ne-SDS-PAGE 電泳分離檢測上清(圖 1-3) 如圖所示，p)緩沖液處理的樣品在的 66KD 處染色深且呈成堆狀，分白（MW=66KD）去除效果不好。pH 5.6(E)緩沖液處理的色最淺，且 20KD 以下小分子蛋白條帶較清晰，表明 pH淀的最佳 pH。

質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；A：正常人 2 倍體積 ACN +0.1%TFA；B：正常上樣量均為 20μl圖 1-8 2 倍 ACN±0.1%TFA 沉淀后血清上清液電泳圖ct Albumin/IgG Removal 試劑盒ract 試劑盒去除正常人、結(jié)核病人血清樣品含量分別為 0.636mg，0.705mg , 而正常人含量分別為 65.7mg，71.1mg，因此它能去除

0.25g 硝酸銀50μl 甲醛用雙蒸水加至 250ml3.65g EDTA-Na2·2H2O用雙蒸水加至 250ml 用雙蒸水漂洗三次 525ml 甘油用雙蒸水加至 250ml結(jié) 果AGE 膠與尿素 SDS-PAGE 膠的比較間膠 10%，分離膠 18%)，樣品跑到分離膠時(shí)開始過始彌散成很寬的條帶，如圖 2-1（I）所示。而尿素%，分離膠 15%）情況明顯改善，如圖 2-1（II）所

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