【摘要】： 前言 為了適應(yīng)胸腔內(nèi)液體的平衡嚴(yán)格控制，胸壁和肺之間要有一種液體吸收和濾出的機(jī)制，液體由壁胸膜通過壓力梯度濾出，由臟層胸膜經(jīng)壓力差、滲透梯度、臟胸膜的淋巴微孔及細(xì)胞機(jī)制吸收。胸膜間皮細(xì)胞在液體吸收中有重要功能，具有離子轉(zhuǎn)運功能及蛋白微泡轉(zhuǎn)運功能，研究表明胸膜間皮細(xì)胞是具有一定通透性的屏障系統(tǒng)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞是相同的。研究證實胸壁的淋巴微孔對微粒及細(xì)胞、蛋白的吸收中起重要的作用，而在液體吸收中不起主要的作用。研究發(fā)現(xiàn)間皮細(xì)胞不僅是完整漿膜腔的組成部分，它參與液體的轉(zhuǎn)運，有干細(xì)胞的功能，參與炎癥反應(yīng)，參與損傷的修復(fù)，防止?jié){膜腔內(nèi)的粘連與腫瘤轉(zhuǎn)移。間皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的水通道蛋白可能在胸腔內(nèi)液體的吸收中起重要作用。 水是生物機(jī)體細(xì)胞的主要成分，時時有大量的水分子通過細(xì)胞膜進(jìn)出細(xì)胞。在純化的人的紅細(xì)胞膜上Rh蛋白時，發(fā)現(xiàn)了一種新的膜蛋白，能明顯加快水的轉(zhuǎn)運。證實它對水有特殊的通透性，后來正式稱為水通道蛋白(Aquaporins：AQPs)，目前已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白亞型，按順序分別命名為AQP_0～AQP_(12)，它們形成了一個AQPs家族。水通蛋白中AQP_1、AQP_2、AQP_4、AQP_5和AQP_8主要參與水的選擇性轉(zhuǎn)運；AQP_3、AQP_7、AQP_9、AQP_(10)參于水和非極性小分子的轉(zhuǎn)運如：甘油、尿素、嘌呤、嘧啶、呼吸道和肺組織目前發(fā)現(xiàn)有AQP_1、AQP_3、AQP_4、AQP_5、AQP_8五種AQP表達(dá)。2人胸膜或人胸膜間皮細(xì)胞上水通道蛋白的表達(dá)情況尚無報道。 為研究間皮細(xì)胞在胸腔內(nèi)液體轉(zhuǎn)運中的作用，本課題分離培養(yǎng)原代胸膜間皮細(xì)胞，研究其在體外培養(yǎng)時的生物學(xué)特性；并對不同標(biāo)本來源的間皮細(xì)胞進(jìn)行對比。以原代間皮細(xì)胞為研究對象檢測其水通道蛋白mRNA的表達(dá)及調(diào)控。對于認(rèn)識間皮細(xì)胞的功能及探討胸膜腔內(nèi)液體的轉(zhuǎn)運機(jī)理有重要價值。 實驗材料與方法 一、胸膜間皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 利用兩種取材方法建立人胸膜間皮細(xì)胞(HPMC)體外培養(yǎng)模型，一是用胰蛋白酶-EDTA消化法，從人肺臟胸膜及壁胸膜上分離胸膜間皮細(xì)胞；二是從胸腔積液中分離胸膜間皮細(xì)胞；進(jìn)行胸膜間皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)。用形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對培養(yǎng)所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 二、胸膜間皮細(xì)胞水通蛋白1～10 mRNA表達(dá)的檢測 利用體外培養(yǎng)的原代人胸膜間皮細(xì)胞，檢測人胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1～10mRNA的表達(dá)，用RT-PCR(reverse transaiption polyrmrease chain reaction)檢測水通道蛋白1～10(AQP_(1～10))mRNA在人胸膜間皮細(xì)胞上的表達(dá)。 三、地塞米松對人胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1 mRNA表達(dá)的影響 臟層與壁層胸膜組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測其AQP_1蛋白水平的表達(dá)；體外培養(yǎng)的人胸膜間皮細(xì)胞，給于糖皮質(zhì)激素(地塞米松)和糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑(RU486)干預(yù)，研究地塞米松對人胸膜間皮細(xì)胞AQP_1mRNA表達(dá)的影響。用RT-PCR檢測人胸膜間皮細(xì)胞上AQP_1 mRNA的表達(dá)情況。實驗分三組：地塞米松組；地塞米松+RU486；對照組。分別給于不同濃度的藥物，作用不同時間，檢測不同組人胸膜間皮細(xì)胞AQP_1 mRNA表達(dá)的差異。 結(jié)果 一、細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 倒置顯微鏡下可見細(xì)胞匯合后呈多角形鋪路石樣，電鏡下可見豐富的微絨毛和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示角蛋白、波形蛋白表達(dá)陽性，抗Ⅷ因子相關(guān)單克隆抗體、抗人白細(xì)胞CD_(45)表達(dá)陰性；排除了成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的可能性；證實為人的胸膜間皮細(xì)胞。兩種方法得到的細(xì)胞純度均在98％以上；具有較好的細(xì)胞活力。兩種取材方法均可以成功建立間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，方法學(xué)上均有可行性。 二、水通蛋白1～10 mRNA表達(dá) 人胸膜間皮細(xì)胞上AQP_(1～10)mRNA均有表達(dá)，AQP_1、AQP_9、AQP_(10)表達(dá)豐富。結(jié)合已知它們的功能，證實人胸膜間皮細(xì)胞參于胸腔內(nèi)液體轉(zhuǎn)運用其它小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。 三、地塞米松干預(yù)實驗 人臟層胸膜與壁層胸膜間皮細(xì)胞上均存在AQP_1蛋白的表達(dá)，且胸膜下血管內(nèi)皮與紅細(xì)胞上也存在AQP_1蛋白的表達(dá)；地塞米松可以增加AQP_1 mRNA的表達(dá)，且有劑量依賴性特點，干預(yù)組與其它兩組比有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001=.AQP_1的主要功能是參與水的跨膜轉(zhuǎn)運，地塞米松增加胸膜間皮細(xì)胞上AQP_1mRNA的表達(dá)，為胸腔積液的治療提供理論依據(jù)。 結(jié)論 一、兩種取材方法均可以成功建立間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，方法學(xué)上均有可行性；手術(shù)標(biāo)本所得細(xì)胞有較高的細(xì)胞純度，取材上胸腔積液更易于得到。第二至三代細(xì)胞具有較好的活力，符合實驗的要求。 二、人胸膜間皮細(xì)胞存在AQP_(1～10) mRNA的表達(dá)，結(jié)合已知它們的功能，進(jìn)而證實人胸膜間皮細(xì)胞參于胸腔內(nèi)液體轉(zhuǎn)運。 三、胸膜間皮細(xì)胞上有AQP_1蛋白的表達(dá)和基因的表達(dá)，AQP_1的主要功能是參與水的跨膜轉(zhuǎn)運，地塞米松增加胸膜間皮細(xì)胞上AQP_1mRNA的表達(dá)，為胸腔積液的治療提供理論指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R561
【圖文】：

、人胸膜間皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定倒置相差顯微鏡下可見:人胸膜間皮細(xì)胞呈多形性，星狀、多角形占多數(shù)，細(xì)胞匯合后呈多邊形鋪路石樣(圖1、圖2);透射電鏡(圖3)與掃描電鏡(圖4)下可見:細(xì)胞表面有微絨毛，細(xì)胞漿內(nèi)豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，未見Welbel一Palade小體.二、免疫組化鑒定采用免疫組化SABC法，分別做抗人波形蛋白、抗人角蛋白、抗人白細(xì)胞CD45、抗Vnl因子相關(guān)抗原的單克隆抗體4種染色;染色結(jié)果為抗人波形蛋白(圖5)、抗人角蛋白染色陽性(圖6)，抗人白細(xì)胞CD45、抗Vlll因子相關(guān)抗原的單克隆抗體陰性(圖6、圖7)。三、細(xì)胞活力和純度消化分離間皮細(xì)胞的活細(xì)胞率在97%以上;胸腔積液得到間皮細(xì)胞的活細(xì)胞率為95%.消化分離的間皮細(xì)胞純度在98%以上，胸腔積液分離的間皮細(xì)胞純度在96%左右.

、人胸膜間皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定倒置相差顯微鏡下可見:人胸膜間皮細(xì)胞呈多形性，星狀、多角形占多數(shù)，細(xì)胞匯合后呈多邊形鋪路石樣(圖1、圖2);透射電鏡(圖3)與掃描電鏡(圖4)下可見:細(xì)胞表面有微絨毛，細(xì)胞漿內(nèi)豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，未見Welbel一Palade小體.二、免疫組化鑒定采用免疫組化SABC法，分別做抗人波形蛋白、抗人角蛋白、抗人白細(xì)胞CD45、抗Vnl因子相關(guān)抗原的單克隆抗體4種染色;染色結(jié)果為抗人波形蛋白(圖5)、抗人角蛋白染色陽性(圖6)，抗人白細(xì)胞CD45、抗Vlll因子相關(guān)抗原的單克隆抗體陰性(圖6、圖7)。三、細(xì)胞活力和純度消化分離間皮細(xì)胞的活細(xì)胞率在97%以上;胸腔積液得到間皮細(xì)胞的活細(xì)胞率為95%.消化分離的間皮細(xì)胞純度在98%以上，胸腔積液分離的間皮細(xì)胞純度在96%左右.

、人胸膜間皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定倒置相差顯微鏡下可見:人胸膜間皮細(xì)胞呈多形性，星狀、多角形占多數(shù)，細(xì)胞匯合后呈多邊形鋪路石樣(圖1、圖2);透射電鏡(圖3)與掃描電鏡(圖4)下可見:細(xì)胞表面有微絨毛，細(xì)胞漿內(nèi)豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，未見Welbel一Palade小體.二、免疫組化鑒定采用免疫組化SABC法，分別做抗人波形蛋白、抗人角蛋白、抗人白細(xì)胞CD45、抗Vnl因子相關(guān)抗原的單克隆抗體4種染色;染色結(jié)果為抗人波形蛋白(圖5)、抗人角蛋白染色陽性(圖6)，抗人白細(xì)胞CD45、抗Vlll因子相關(guān)抗原的單克隆抗體陰性(圖6、圖7)。三、細(xì)胞活力和純度消化分離間皮細(xì)胞的活細(xì)胞率在97%以上;胸腔積液得到間皮細(xì)胞的活細(xì)胞率為95%.消化分離的間皮細(xì)胞純度在98%以上，胸腔積液分離的間皮細(xì)胞純度在96%左右.

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 袁維堂;功能性便秘的病理生理、分型及手術(shù)治療研究[D];鄭州大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 秦佳敏;AQP9在大鼠消化道定位及AQP4在胃粘膜損傷修復(fù)過程中作用機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2006年

2 孫超超;水通道蛋白在正常及異常人子宮內(nèi)膜中的表達(dá)[D];浙江大學(xué);2006年

本文編號：2747913