【摘要】： 煙曲霉(Af)是目前最常見的空氣傳播的真菌感染病原體，可導(dǎo)致免疫受損患者發(fā)生嚴(yán)重且往往是致死性的侵襲性肺曲霉病(IPA)。隨著免疫受損患者的增多，IPA發(fā)病率顯著增加，已成為目前免疫受損患者最常見的肺部感染性疾病之一。在過去的十余年中，盡管不斷有新的抗真菌藥物問世，但由于IPA早期診斷困難且病情進(jìn)展迅速，其病死率仍居高不下。故開展機(jī)體抵御煙曲霉感染的免疫反應(yīng)機(jī)制研究，探索預(yù)防和治療煙曲霉感染的新措施，對于降低IPA發(fā)病率和病死率具有十分重要的意義。 先天性免疫系統(tǒng)是機(jī)體識別、抵御病原體感染的第一道防線，它通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)來迅速識別病原體。目前研究最多的PRRs為Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)，已被證實與抗煙曲霉感染免疫反應(yīng)有關(guān)。另一類PRRs是近年來才發(fā)現(xiàn)的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide- binding oligomerization domain，NOD)蛋白。NOD蛋白為胞漿內(nèi)蛋白，目前認(rèn)為它們與識別細(xì)胞內(nèi)病原體有關(guān)。已知的NOD蛋白家族成員有20余種，其中最為重要的是NOD1和NOD2。NOD1又稱CARD(caspase recruitment domain)-4蛋白，在全身各種組織細(xì)胞中都有分布，識別主要存在于革蘭陰性菌中的肽聚糖(PGN)的降解產(chǎn)物GM-triDAP。NOD2又稱CARD15，分布主要局限于上皮細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，識別的最小基序為胞壁酰二肽(MDP)。MDP同時存在于革蘭陰性和陽性細(xì)菌胞壁PGN的降解產(chǎn)物中。盡管NOD1和NOD2識別的配體不同，但它們都是通過受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，RIP2)來激活NF-κB信號通路，促進(jìn)一系列細(xì)胞因子的合成。已經(jīng)證實NOD蛋白與多種細(xì)菌感染免疫反應(yīng)有關(guān)。 煙曲霉孢子通過空氣傳播，由于其體積小，可順利進(jìn)入下呼吸道，當(dāng)條件適宜生長時便出芽形成菌絲，侵襲組織細(xì)胞，造成組織損傷。肺上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞作為肺部先天性免疫的主要組成細(xì)胞，能夠吞噬、殺滅煙曲霉孢子，釋放出一系列炎癥細(xì)胞因子，在抵御煙曲霉感染中發(fā)揮重要作用。已有研究表明PRRs在先天性免疫系統(tǒng)占有重要地位，但迄今為止NOD蛋白在肺組織中的表達(dá)僅有少量研究報道，尚未見NOD蛋白在抗煙曲霉感染免疫反應(yīng)中作用的研究報道。鑒于煙曲霉系胞內(nèi)感染病原體，我們假設(shè)NOD蛋白可能為煙曲霉的胞漿內(nèi)PRRs。本研究通過建立煙曲霉肺部感染小鼠模型及A549、THP1細(xì)胞的培養(yǎng)來研究肺組織中NOD相關(guān)蛋白的表達(dá)及對煙曲霉孢子的識別機(jī)制。 第一部分NOD相關(guān)蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達(dá) 目的：觀察NOD相關(guān)蛋白在煙曲霉感染小鼠肺部組織中的表達(dá)。方法：60只雄性BALB／c小鼠隨機(jī)分成2組，每組30只。通過經(jīng)鼻滴入煙曲霉孢子的方法建立煙曲霉肺部感染小鼠模型，對照組小鼠經(jīng)鼻滴入等量的生理鹽水。分別在感染前(0h)、感染后6h、12h、24h、48h觀察肺部煙曲霉負(fù)荷及病理學(xué)改變。采用RT-PCR方法檢測各時間點(diǎn)的NOD1、NOD2及RIP2 mRNA在肺組織中的表達(dá)。采用免疫組化的方法檢測各時間點(diǎn)兩組小鼠肺組織NOD2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：(1)感染組小鼠肺部煙曲霉負(fù)荷24h達(dá)最高峰，48h迅速下降。(2)兩組小鼠肺組織均表現(xiàn)為支氣管肺泡炎癥為主的病理改變。感染組小鼠24h炎癥反應(yīng)最顯著，48h減輕。對照組小鼠病理損害明顯輕于感染組。(3)接種煙曲霉前(0h)、后6h、12h、24h、48h NOD1 mRNA表達(dá)量分別為0.34±0.05、0.41±0.08、0.46±0.07、0.47±0.04、0.47±0.48；NOD2 mRNA表達(dá)量分別為0.30±0.03、0.36±0.06、0.45±0.10、0.60±0.06、0.73±0.08；RIP2 mRNA表達(dá)量分別為0.44±0.10、0.56±0.09、0.62±0.07、0.64±0.07、0.63±0.06。感染后12h、24h、48h NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表達(dá)上調(diào)，同感染前(0h)相比有顯著差異(P＜0.05)。NOD2 mRNA的表達(dá)上調(diào)比NOD1更加明顯。對照組各時間點(diǎn)NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表達(dá)無顯著差異。感染組和對照組比較除0h、6h外各時間點(diǎn)NOD1、RIP2 mRNA表達(dá)均有顯著差異(P＜0.05)。除0h外兩組各時間點(diǎn)NOD2 mRNA表達(dá)有顯著差異(P＜0.05)。(4)NOD2蛋白表達(dá)主要分布在肺泡上皮細(xì)胞。感染組小鼠肺組織0h、12h、24h、48h時NOD2蛋白免疫組化陽性指數(shù)分別為117582.7±20189.58、163854.4±17185.61、341363.9±35102.07、289114.5±38424.35，24h NOD2蛋白表達(dá)同0h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。對照組各時間點(diǎn)NOD2蛋白表達(dá)無顯著差異。感染組、對照組組間比較24h、48h NOD2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：煙曲霉肺部感染后肺組織中NOD相關(guān)蛋白(尤其是NOD2)表達(dá)增加，提示NOD相關(guān)蛋白尤其是NOD2與煙曲霉肺部感染有關(guān)，可能參與了抗煙曲霉肺部感染的免疫反應(yīng)。 第二部分A549、THP1細(xì)胞中NOD2蛋白的表達(dá)與煙曲霉孢子刺激及TNF-α分泌的相關(guān)性研究 目的：觀察滅活煙曲霉孢子刺激人肺泡上皮細(xì)胞株A549及人單核／吞噬細(xì)胞株THP1后細(xì)胞中NOD2蛋白和NOD2蛋白的下游物RIP2激酶的表達(dá)，以及MDP對Af孢子刺激上述細(xì)胞分泌TNF-α的影響，探討NOD2蛋白在機(jī)體抗煙曲霉感染免疫反應(yīng)中的作用。方法：(1)透射電鏡觀察A549、THP1細(xì)胞與煙曲霉孢 子孵育10h、24h、48h后細(xì)胞及胞漿內(nèi)孢子的形態(tài)。(2)Real-time PCR檢測A549、THP1細(xì)胞在煙曲霉孢子刺激前(0h)、后24h、48h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達(dá)。(3)Real-time PCR檢測不同刺激強(qiáng)度的煙曲霉孢子刺激A549、THP1細(xì)胞后NOD2 mRNA表達(dá)。(4)免疫熒光法觀察煙曲霉孢子刺激A549細(xì)胞后NOD2蛋白的表達(dá)。(5)采用免疫沉降后western blot的方法檢測不同刺激強(qiáng)度的煙曲霉孢子刺激A549、THP1細(xì)胞后NOD2蛋白的表達(dá)。(6)ELISA法檢測煙曲霉孢子單獨(dú)和聯(lián)合NOD2的特異性配體MDP刺激A549、THP1細(xì)胞后TNF-α的分泌。結(jié)果：(1)煙曲霉孢子與A549、THP1孵育10h后胞漿內(nèi)即可見到吞噬的孢子，24h時溶酶體內(nèi)可見到部分消化狀態(tài)的煙曲霉孢子。(2)A549、THP1細(xì)胞在煙曲霉孢子刺激后24h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，與0h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。48h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達(dá)均減少。(3)煙曲霉孢子刺激A549、THP1細(xì)胞后NOD2 mRNA表達(dá)水平隨刺激強(qiáng)度的增加而上調(diào)，各組間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4)免疫熒光法可見煙曲霉孢子刺激后NOD2蛋白表達(dá)增加。(5)煙曲霉孢子刺激A549、THP1細(xì)胞后NOD2蛋白的表達(dá)增加，不同刺激強(qiáng)度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(6)空白對照組、MDP單獨(dú)刺激、煙曲霉孢子單獨(dú)刺激、煙曲霉孢子聯(lián)合MDP刺激組4組A549細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量分別為10.46±0.70、11.36±1.20、12.63±2.76、13.94±3.42 pg／ml；4組THP1細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量分別為27.40±5.72、27.93±9.11、32.63±4.71、82.13±10.76 pg／ml。MDP能夠顯著增加煙曲霉孢子刺激后細(xì)胞TNF-α的分泌(P＜0.05)。結(jié)論：NOD2蛋白的表達(dá)與煙曲霉孢子的吞噬和消化密切相關(guān)，并在促進(jìn)TNF-α分泌方面發(fā)揮一定作用。其作用可能是作為PRRs識別煙曲霉孢子的降解產(chǎn)物，并通過RIP2激酶激活下游信號通路，促進(jìn)TNF-α分泌。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R519
【圖文】：

第一部分NOD相關(guān)蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達(dá)圖1一2正常肺組織(X400)圖1一3接種Af后12h，肺泡間隔增寬，充血，炎癥細(xì)胞浸潤 (x400)

第一部分NOD相關(guān)蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達(dá)圖1一2正常肺組織(X400)圖1一3接種Af后12h，肺泡間隔增寬，充血，炎癥細(xì)胞浸潤 (x400)

第一部分NOD相關(guān)蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達(dá)圖1一4接種Af后24h，肺泡壁明顯增厚，充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡塌陷，肺泡腔實變，充滿炎癥細(xì)胞(x400)圖1一5接種Af后48h，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，肺泡間隔仍增寬、充血 (X400)

【共引文獻(xiàn)】

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1 駱志成;曲霉感染的PCR檢測[J];國外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊);1998年06期

2 歐陽浩淼;金城;;煙曲霉細(xì)胞壁及其GPI錨定結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J];廣西科學(xué);2014年02期

3 榮令;周新;;中性粒細(xì)胞減少小鼠侵襲性肺曲霉病模型的構(gòu)建[J];中國感染與化療雜志;2008年05期

4 李家樹;榮令;;氬氣刀治療阻塞性曲霉支氣管炎1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J];臨床肺科雜志;2010年11期

5 孫燁;朱奇志;杜湘珂;;白血病異基因骨髓移植后晚期肺曲霉菌病CT特征[J];臨床放射學(xué)雜志;2009年02期

6 金城;;絲狀真菌糖生物學(xué)[J];生命科學(xué);2011年06期

7 姜毓麗;張望剛;陳國神;;提高蛋白質(zhì)及多肽類藥物肺部給藥生物利用度的方法及其作用機(jī)制[J];中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué);2005年06期

8 羅良平;劉灶松;;造血干細(xì)胞移植后肺部感染的特點(diǎn)及CT診斷[J];中國醫(yī)學(xué)計算機(jī)成像雜志;2010年05期

9 劉軍;沈永年;呂桂霞;陳偉;劉維達(dá);;侵襲性曲霉病兔模型的構(gòu)建[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2006年08期

10 劉景院;徐云良;魏麗榮;王慧珠;宋麗紅;;肝衰竭合并侵襲性肺曲霉菌病的危險因素和胸部影像特征分析[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2013年05期

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1 湯斌;Asp f2變應(yīng)原的分子生物學(xué)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2001年

2 王莉;侵襲性曲霉感染實驗室檢測的基礎(chǔ)與臨床研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 廖軍;肺泡巨噬細(xì)胞與煙曲霉相互作用的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

4 劉軍;深部真菌感染的快速分子診斷及其臨床應(yīng)用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

5 祝敏芳;獨(dú)立生長因子1在內(nèi)毒素耐受中的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

6 申玉英;煙曲霉感染對HUVEC表達(dá)TF、vWF及細(xì)胞凋亡的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

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3 顧克菊;免疫抑制宿主Toll樣受體表達(dá)及對煙曲霉菌感染免疫應(yīng)答[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

4 蔣彤;肺病患者呼吸道真菌的檢測及分子鑒定[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

5 李曉瑾;dsRNA介導(dǎo)的RNAi沉默煙曲霉菌毒力相關(guān)基因arp1和nudC的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

6 顧銅杰;54例肺曲霉病臨床分析[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

7 陳先華;煙曲霉對人中性粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

8 符少平;ZafA基因沉默對煙曲霉菌生長、毒力的影響[D];暨南大學(xué);2009年

9 劉灶松;造血干細(xì)胞移植受者肺部并發(fā)癥的CT表現(xiàn)及臨床分析[D];暨南大學(xué);2010年

10 常虹;菌株P(guān)NR2次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與抗菌活性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號：2746354