發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 07:00

【摘要】：背景急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種急性彌漫性肺部炎性反應(yīng),可導(dǎo)致肺血管的通透性增加,肺泡水腫及透明膜形成,肺重量增加。目前,ARDS仍然是影響人類(lèi)健康的重大疾病,雖在治療上有一定突破,中重癥ARDS患者的病死率仍在40%以上。其中,肺纖維化可能是影響ARDS患者死亡率的重要因素。ARDS相關(guān)性肺纖維化與多種因素相關(guān),其中目前廣泛應(yīng)用的機(jī)械通氣可能會(huì)加重肺損傷使肺纖維化發(fā)生,酸誤吸也能引起吸入性肺炎從而引起肺纖維化。酸誤吸加重炎癥反應(yīng),研究表明酸吸入能損傷肺上皮引起肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,后者為纖維化的重要機(jī)制。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是成熟分化的上皮細(xì)胞失去細(xì)胞形態(tài)、極性及粘附能力獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程,EMT可加速細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成,是肝、腎、肺及其他臟器纖維化的重要機(jī)制.趨化因子受體7(CXCR7)能改變細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞再生,調(diào)控炎癥及免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。在小鼠模型中,CXCR7能抑制肺纖維化,并改善肺上皮損傷,機(jī)制未明。本研究我們以人肺上皮細(xì)胞為主要研究對(duì)象,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究鹽酸導(dǎo)致人肺上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中CXCR7的抑制作用,探討ARDS酸誤吸中的肺修復(fù)和重塑機(jī)制。目的研究CXCR7在鹽酸誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)及CXCR7對(duì)人肺上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的抑制作用,為闡明肺上皮在肺纖維化中的發(fā)病機(jī)理提供分子理論依據(jù)及為肺纖維化的診治提供新的治療靶分子。方法分別采用鹽酸培養(yǎng)基及單純培養(yǎng)基預(yù)處理BEAS-2B細(xì)胞30分鐘,隨后平行觀察至48h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)炎癥因子IL-6,IL-8;應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)鹽酸處理后EMT的蛋白標(biāo)志物:E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞角蛋白-8(Cytokeratin-8,CK-8)、表面活性蛋白B(SP-B)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及CXCR7的表達(dá)情況。同等條件下加入應(yīng)用CXCR7激動(dòng)劑TC14012觀察TC14012處理前后的炎癥因子及EMT蛋白標(biāo)志物表達(dá)情況。結(jié)果1.鹽酸培養(yǎng)基30分鐘預(yù)處理人肺上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,表現(xiàn)為:細(xì)胞形態(tài)由卵圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,細(xì)胞間隙增大;上皮標(biāo)志物E-cadherin、CK-8、SPB蛋白表達(dá)下降,間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)增高、炎癥因子IL-6,IL-8表達(dá)增高。2.鹽酸培養(yǎng)基30分鐘預(yù)處理使CXCR7的表達(dá)下降。3.TC14012可部分逆轉(zhuǎn)鹽酸培養(yǎng)基30分鐘預(yù)處理對(duì)炎癥因子的升高,也可部分逆轉(zhuǎn)其對(duì)EMT蛋白標(biāo)志物中上皮標(biāo)志物的表達(dá)降低及間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)增高。結(jié)論鹽酸預(yù)處理使人肺上皮細(xì)胞炎癥因子升高,發(fā)生EMT并下調(diào)CXCR7的表達(dá)。CXCR7激動(dòng)劑TC14012使CXCR7表達(dá)升高,并有使EMT減輕的趨勢(shì)。CXCR7可能是ARDS相關(guān)肺纖維化新的重要發(fā)病機(jī)制和潛在治療目標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R563
【圖文】：

第四章 結(jié)果部分：鹽酸誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B 間質(zhì)轉(zhuǎn)分化型的建立鹽酸對(duì)人肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響鹽酸培養(yǎng)基及單純培養(yǎng)基處理細(xì)胞 30 分鐘后換成完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分組及鹽酸組。觀察鏡下結(jié)果，倒置顯微鏡下可見(jiàn) BEAS-2B 細(xì)胞在對(duì)照鵝卵圓形，細(xì)胞緊密相連，細(xì)胞間極性存在；而在鹽酸組，刺激后 6 小胞出現(xiàn)長(zhǎng)梭形，刺激后 24 小時(shí)可觀察到大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，顯間隙，極性消失，部分細(xì)胞不再貼壁而懸浮于培養(yǎng)基中。

圖 1.2 對(duì)照組與鹽酸組 24 小時(shí)細(xì)胞毒性比例統(tǒng)計(jì)分析圖，n=4 鹽酸誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B 模型中炎癥因子 IL-6，IL表達(dá)上調(diào)為了模型中炎癥反應(yīng)的情況，采用 q-PCR 法檢測(cè)炎癥因子 IL-6 及 IL-8NA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示：鹽酸誘導(dǎo) 1 小時(shí)后，IL-6 及 IL-8 的 mRNA 表達(dá)照組均上調(diào)，因此可以認(rèn)為鹽酸誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B 模型引起細(xì)損傷。

圖 1.2 對(duì)照組與鹽酸組 24 小時(shí)細(xì)胞毒性比例統(tǒng)計(jì)分析圖，n=41.3 鹽酸誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B 模型中炎癥因子 IL-6，IL-8表達(dá)上調(diào)為了模型中炎癥反應(yīng)的情況，采用 q-PCR 法檢測(cè)炎癥因子 IL-6 及 IL-8 的mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示：鹽酸誘導(dǎo) 1 小時(shí)后，IL-6 及 IL-8 的 mRNA 表達(dá)對(duì)比對(duì)照組均上調(diào)，因此可以認(rèn)為鹽酸誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B 模型引起細(xì)胞炎癥損傷。

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本文編號(hào)：2746237