【摘要】： 急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是以肺內(nèi)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤、肺組織循環(huán)障礙、肺毛細(xì)血管通透性增加及低氧血癥為特征的常見臨床綜合征,預(yù)后差、病情兇險(xiǎn),可迅速進(jìn)展為多臟器功能衰竭,病死率為30%～70%,防治本類疾病具有非常重要的臨床意義。雖然國內(nèi)外已進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)與臨床研究,但仍未完全闡明ALI病理演變過程及發(fā)病機(jī)制,且藥物治療效果不佳,常以小潮氣量保護(hù)性機(jī)械通氣來降低死亡率。 初步使用的ALI治療藥物有血管舒張劑的吸入治療(一氧化氮吸入、前列環(huán)素吸入及外源性肺表面活性物質(zhì)等)、腎上腺糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥物、酮康唑(ketoconazole)等,但存在療效不滿意或嚴(yán)重的不良反應(yīng)等問題,因此,迄今尚無強(qiáng)力的、安全有效的藥物治療手段。 目前對(duì)有關(guān)中性粒細(xì)胞肺內(nèi)扣押、過度激活及導(dǎo)致肺微血管通透性增高的機(jī)制和相應(yīng)信號(hào)調(diào)控機(jī)制的早期藥物干預(yù)正成為尋找ALI抗炎治療藥物的重要手段。研究認(rèn)為,氧自由基(Oxygen free radicals,OFR)損傷是中性粒細(xì)胞聚集、跨膜遷徙、活化后引起肺實(shí)質(zhì)和肺微血管損害等過度失控的炎癥反應(yīng)的最主要機(jī)制之一�？寡趸瘎┲鸩郊{入我們的視線。ALI時(shí),活化的中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生超大量的活性氧類,包括羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等,導(dǎo)致蛋白核酸變性和生物膜破壞,并且促使更進(jìn)一步中性粒細(xì)胞聚集而導(dǎo)致肺損傷的惡性進(jìn)展。 依達(dá)拉奉(edaravone,MCI-186),化學(xué)名:3-甲基-1-苯基-吡唑啉-5-酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one),是日本三菱制藥公司研發(fā),2001年6月在日本上市,迄今為止,依達(dá)拉奉是全球進(jìn)入三期臨床使用的最新型強(qiáng)抗氧化劑,具有強(qiáng)大的自由基清除作用,臨床已經(jīng)有效用于治療急性腦梗塞。近來動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn),依達(dá)拉奉能降低毛細(xì)血管壁的通透性、改善微循環(huán)、具有強(qiáng)大的細(xì)胞保護(hù)作用及抑制溶酶體的釋放等抗炎效應(yīng),提示著依達(dá)拉奉可能具有治療ALI的作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉對(duì)ALI模型保護(hù)作用的病理生理和分子機(jī)制多層面綜合研究報(bào)道。因此,本研究將選用脂多糖內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)ALI大鼠在體模型,擬從整體的病生指標(biāo)、分子水平綜合性將新型抗氧化藥物依達(dá)拉奉對(duì)ALI的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行研究,旨在從抗氧化藥物途徑上為依達(dá)拉奉治療ALI提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究的第一、第二章主要從肺部炎癥反應(yīng)的病理形態(tài)學(xué)、肺氣體交換能力、肺組織通透性、中性粒細(xì)胞活化扣押、氧化/抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)等角度,多角度驗(yàn)證新型抗氧化劑依達(dá)拉奉是否對(duì)ALI具有保護(hù)作用�；诤艘蜃应蔅(nuclear factor ofκB,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑在ALI發(fā)病機(jī)制中的重要作用和密切關(guān)系,我們研究的第三、第四章主要從分子水平來驗(yàn)證新型抗氧化劑依達(dá)拉奉對(duì)ALI的保護(hù)作用是否與抑制MAPK信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白MAPK的三個(gè)家族成員p38MAPK、JNK(c-Jun N-terminal kinase)、ERK(extracellularsignal-regulated kinase)蛋白激酶和NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白NF-κB的活化相關(guān)。 LPS誘導(dǎo)ALI模型的制作和分組:依據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定和驗(yàn)證ALI模型的制作,選擇雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(Ⅱ級(jí)清潔等級(jí)),從尾靜脈迅速推注LPS(5mg/kg),使氧和指數(shù)＜300,6小時(shí)后配置10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉后再行進(jìn)一步操作。依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將入選的SD大鼠分成6組(每組8只):(1)正常對(duì)照組(A組);(2)LPS致傷組(B組);(3)LPS+Edaravone高劑量組(C組);(4)LPS+Edaravone中劑量組(D組);(5)LPS+Edaravone低劑量組(E組);(6)陽性對(duì)照LPS+地塞米松(DEX)組(F組)。B、C、D、E、F組大鼠各依照參考文獻(xiàn)制作ALI模型;正常對(duì)照的A組經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水,余組皆注入LPS(5mg/kg),此外,在LPS注入得前30分,LPS造模的B組注射等容積的生理鹽水;C組注射等容積的Edaravone溶液(3.0mg/kg);D組注射等容積的Edaravone溶液(1.0mg/kg);E組注射等容積的Edaravone溶液(0.3mg/kg);F組注射等容積的DEX溶液(3mg/kg)。 目的: 探討依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI大鼠的保護(hù)作用及分子機(jī)制,旨在從新的抗氧化藥物途徑上為治療ALI提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 第一章依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及病生機(jī)制分析:測定多項(xiàng)動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo),肺通透性指數(shù)(lung permeability index,LPI)、肺含水量、濕/干重(wet to dry weight ratio,W/D)比值及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量,光鏡、電鏡觀察肺組織病理形態(tài)變化。 第二章依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖內(nèi)毒素急性肺損傷中性粒細(xì)胞肺內(nèi)扣押與氧自由基損傷的抑制作用:測定各組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)計(jì)數(shù)比例,測定肺組織、血清中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。 第三章依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB活性的影響:采用蛋白免疫印跡法(Lowry法和Western blot法)檢測肺組織磷酸化NF-κB的表達(dá)。 第四章依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織MAPKs(p38,JNK,ERK)活性的影響:采用蛋白免疫印跡方法(Lowry法和Westernblot法)分三節(jié)分別測定肺組織磷酸化p38MAPK、JNK、ERK的表達(dá)。 結(jié)果: 第一章:依達(dá)拉奉能顯著降低ALI大鼠動(dòng)脈血PaCO_2值、肺通透性指數(shù)、肺水含量、肺濕/干重比值、BALF中的蛋白含量(P＜0.05),提高ALI大鼠動(dòng)脈血PaO_2值、氧和指數(shù)及PH值(P＜0.05),并顯著減輕ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,改善肺部炎癥病理改變,依達(dá)拉奉對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI大鼠保護(hù)作用呈一定得劑量-效應(yīng)關(guān)系。 第二章:依達(dá)拉奉顯著降低ALI大鼠支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺組織中丙二醛含量、髓過氧化物酶活性和血清中丙二醛含量、乳酸脫氫酶活性,顯著提高肺組織和血清中的超氧化物歧化酶活性(P＜0.01,或P＜0.05),并且,依達(dá)拉奉對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷氧自由基損傷和中性粒細(xì)胞肺內(nèi)扣押的抑制作用呈一定得劑量-效應(yīng)關(guān)系。 第三章:LPS誘導(dǎo)ALI模型組大鼠的肺組織磷酸化NF-κB的表達(dá)比正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.01),而與LPS誘導(dǎo)ALI模型組比,依達(dá)拉奉高、中劑量組能顯著抑制大鼠肺組織磷酸化NF-κB的表達(dá)(P＜0.01及P＜0.05),并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。 第四章:LPS誘導(dǎo)ALI模型組大鼠的肺組織磷酸化p38MAPK、JNK、ERK的表達(dá)比正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.01),與LPS誘導(dǎo)ALI模型致傷組相比,依達(dá)拉奉高劑量組和中等劑量組均能顯著抑制大鼠肺組織磷酸化p38MAPK、JNK,ERK的表達(dá)(P＜0.01和P＜0.05)。 結(jié)論: 依達(dá)拉奉能減輕LPS誘導(dǎo)ALI微血管屏障破壞,提高肺部氣體交換功能,強(qiáng)力抑制ALI的肺部炎癥反應(yīng)和通透性增高;能發(fā)揮出抑制ALI中性粒細(xì)胞肺內(nèi)扣押、聚集及減輕繼發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的嚴(yán)重?fù)p害,迅速扭轉(zhuǎn)氧化/抗氧化平衡系統(tǒng)的失調(diào);從分子機(jī)制分析,依達(dá)拉奉對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI的保護(hù)作用與依達(dá)拉奉抑制LPS誘導(dǎo)NF-κB的過度活化存在密切聯(lián)系;同時(shí),依達(dá)拉奉也參與阻斷ALI炎癥反應(yīng)另一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.MAPKs的三個(gè)關(guān)鍵蛋白激酶(P38MAPK,ERK和JNK)的磷酸化,從炎癥鏈的上游瓶頸處阻斷ALI炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激化和繼發(fā)性損害。進(jìn)入三期臨床的新型強(qiáng)抗氧化劑——依達(dá)拉奉有可能成為抗氧化抗氧化途徑治療ALI新的藥物選擇,本研究為此提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R563
【圖文】：

光鏡下(x400倍)觀察:A組為正常對(duì)照組，大鼠肺組織，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及間質(zhì)內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤

光鏡下(x40o倍)觀察:D組為依達(dá)拉奉中劑量組，肺組織輕度水腫，見多量炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李榜龍;探討抗氧化劑對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用[D];南華大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2741132