【摘要】：NETosis,是指中性粒細(xì)胞釋放胞外捕獲網(wǎng)(Neutrophil Extracellular Traps,NETs)的動(dòng)態(tài)過程,是一種新型的殺菌機(jī)制。當(dāng)中性粒細(xì)胞受到微生物或其他因素刺激后,胞體從球狀變成扁平,核膜、胞膜相繼崩解破裂,DNA等核酸物質(zhì)和胞漿顆粒蛋白融合,繼而釋放到胞外,形成可以捕殺細(xì)菌的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。由于NETs包含高濃度蛋白水解酶,過量的NETs釋放不可避免導(dǎo)致宿主組織損傷。急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是各種致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,繼而造成急性低氧性呼吸功能不全,發(fā)病率及致死率較高。已有研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷的發(fā)病與大量中性粒細(xì)胞活化并積聚在肺組織有關(guān),且急性肺損傷患者外周血具有較高濃度游離DNA。然而,活化的中性粒細(xì)胞的組織毒性是否與其釋放NETs有關(guān),以及緩解NETs釋放是否能減輕肺組織損傷,還有待進(jìn)一步闡明。而且臨床上尚缺乏治療急性肺損傷的針對(duì)性藥物�；陔娢⒆杩沟膶�(shí)時(shí)細(xì)胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)系統(tǒng)可以監(jiān)測到特定的靶細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界多種刺激時(shí)的時(shí)間劑量依賴性反應(yīng)圖譜(Time-dependent Cell Response Patterns,TCRPs)。在本研究中,我們運(yùn)用xCELLigence實(shí)驗(yàn)儀器,基于TCRPs技術(shù)構(gòu)建了 一套新型的動(dòng)態(tài)評(píng)估NETosis的方法:首先在RTCA系統(tǒng)上根據(jù)不同細(xì)胞密度的生長曲線差異優(yōu)化建立穩(wěn)定的肺上皮屏障,然后在肺上皮屏障的細(xì)胞平臺(tái)期時(shí)加入待檢測的不同處理?xiàng)l件下的中性粒細(xì)胞,通過中性粒細(xì)胞與肺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)狀態(tài)下二者之間的相互作用使微阻抗信號(hào)發(fā)生改變從而動(dòng)態(tài)反映中性粒細(xì)胞的狀態(tài),其TCRPs圖譜結(jié)果表明LPS激活的中性粒細(xì)胞破壞肺上皮細(xì)胞骨架、促使細(xì)胞凋亡從而誘導(dǎo)上皮屏障損傷,細(xì)胞指數(shù)(Cell Index,CI)呈現(xiàn)下降趨勢。接下來,將體外提取的NETs于平臺(tái)期加入肺上皮屏障中也可觀測到類似的CI下降及細(xì)胞損傷效應(yīng)。為進(jìn)一步研究,活化的中性粒細(xì)胞對(duì)肺上皮細(xì)胞的毒副作用是否與其釋放NETs的能力有關(guān),我們運(yùn)用NADPH酶抑制劑DPI預(yù)處理中性粒細(xì)胞來阻滯NETosis過程,通過比較TCRPs發(fā)現(xiàn),區(qū)別于LPS激活的中性粒細(xì)胞造成嚴(yán)重的肺上皮CI下降,DPI預(yù)處理的中性粒細(xì)胞對(duì)肺上皮的損傷效應(yīng)明顯遏制,CI下降趨勢明顯緩解。由此,我們得出結(jié)論激活態(tài)中性粒細(xì)胞釋放NETs是其具有細(xì)胞毒作用的原因之一,且基于TCRPs的分析技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測肺上皮屏障的CI趨勢改變可以實(shí)時(shí)反映NETosis的誘導(dǎo)/阻滯進(jìn)程。我們所建立的這種基于TCRPs的NETosis動(dòng)態(tài)分析模型可以定性定量分析不同處理?xiàng)l件下或不同樣本來源的中性粒細(xì)胞所造成的上皮損傷效應(yīng)的差異,從而分析其釋放NETs水平的不同。接下來我們想深入探究目前創(chuàng)建的這種方法是否在ALI的疾病診斷和治療上是否有臨床應(yīng)用價(jià)值。ALI的主要病因是肺部炎癥和感染,因此我們選定的疾病人群是肺炎患者。通過比較靜脈血液樣本,我們發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組相比,重癥肺炎患者外周血中性粒細(xì)胞對(duì)肺上皮損傷更嚴(yán)重,造成的上皮CI下降趨勢更明顯,與其釋放NETs的能力更劇烈有關(guān),這與其他常規(guī)的NETs檢測方法的驗(yàn)證結(jié)果一致。中性粒細(xì)胞釋放NETs的能力與炎癥環(huán)境下中性粒細(xì)胞受到炎性刺激有關(guān),因此我們嘗試檢測糖皮質(zhì)激素及幾種常見非甾體抗炎藥物對(duì)NETosis 阻滯作用,TCRPs結(jié)果顯示阿司匹林和對(duì)乙酰氨基酚可顯著抑制NETs釋放,緩解中性粒細(xì)胞對(duì)肺上皮的損傷效應(yīng),與前人研究結(jié)果一致,進(jìn)一步證明了基于微電子阻抗動(dòng)態(tài)監(jiān)測NETosis體系的可行性,同時(shí)也表明我們所創(chuàng)建的NETosis動(dòng)態(tài)分析模型具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值�？傊�,我們運(yùn)用xCELLigence儀器基于TCRPs技術(shù)所建立的NETosis實(shí)時(shí)分析模型與傳統(tǒng)方法相比,具有無標(biāo)記、動(dòng)態(tài)連續(xù)、高通量的優(yōu)勢,為定性定量評(píng)估中性粒細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞釋放的NETs對(duì)宿主肺上皮組織的損傷效應(yīng)以及解釋ALI的發(fā)病機(jī)制提供了新的工具,且便于后續(xù)臨床開拓廣泛用于疾病診斷及篩選抑制NETs釋放的藥物,有助于推動(dòng)ALI的治療進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R563
【圖文】：

本課題所采用的是ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析（ＲＴＣＡ）邋ＳＰ儀器（如逡逑圖１示），該系統(tǒng)配套的監(jiān)測組件是實(shí)時(shí)微電子撿測板，即一個(gè)底部整合有微電逡逑子芯片的Ｅ－９６孔板（如圖２示）。將儀器被放置于標(biāo)準(zhǔn)的Ｃ０２培養(yǎng)箝中，通過電逡逑纜接口與在外部的分析和控制單元進(jìn)行連接，利用電子阻抗值來記錄細(xì)胞的行為逡逑變化，在屏幕實(shí)時(shí)顯示ＴＣＲＰｓ圖譜。逡逑ｒｍ逡逑通灥■逡逑■邐■■■■里蜃逡逑圖２．邋ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀邐圖３．邋Ｅ－ｐｌａｔｅ邋９６細(xì)胞培養(yǎng)板逡逑５逡逑

圖３．邋Ｅ－ｌａｔｅ邋９６細(xì)培板逡逑

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本文編號(hào)：2739353