【摘要】：NETosis,是指中性粒細胞釋放胞外捕獲網(Neutrophil Extracellular Traps,NETs)的動態(tài)過程,是一種新型的殺菌機制。當中性粒細胞受到微生物或其他因素刺激后,胞體從球狀變成扁平,核膜、胞膜相繼崩解破裂,DNA等核酸物質和胞漿顆粒蛋白融合,繼而釋放到胞外,形成可以捕殺細菌的纖維網狀結構物質。由于NETs包含高濃度蛋白水解酶,過量的NETs釋放不可避免導致宿主組織損傷。急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是各種致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷,繼而造成急性低氧性呼吸功能不全,發(fā)病率及致死率較高。已有研究發(fā)現急性肺損傷的發(fā)病與大量中性粒細胞活化并積聚在肺組織有關,且急性肺損傷患者外周血具有較高濃度游離DNA。然而,活化的中性粒細胞的組織毒性是否與其釋放NETs有關,以及緩解NETs釋放是否能減輕肺組織損傷,還有待進一步闡明。而且臨床上尚缺乏治療急性肺損傷的針對性藥物�；陔娢⒆杩沟膶崟r細胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)系統(tǒng)可以監(jiān)測到特定的靶細胞應對外界多種刺激時的時間劑量依賴性反應圖譜(Time-dependent Cell Response Patterns,TCRPs)。在本研究中,我們運用xCELLigence實驗儀器,基于TCRPs技術構建了 一套新型的動態(tài)評估NETosis的方法:首先在RTCA系統(tǒng)上根據不同細胞密度的生長曲線差異優(yōu)化建立穩(wěn)定的肺上皮屏障,然后在肺上皮屏障的細胞平臺期時加入待檢測的不同處理條件下的中性粒細胞,通過中性粒細胞與肺上皮細胞共培養(yǎng)狀態(tài)下二者之間的相互作用使微阻抗信號發(fā)生改變從而動態(tài)反映中性粒細胞的狀態(tài),其TCRPs圖譜結果表明LPS激活的中性粒細胞破壞肺上皮細胞骨架、促使細胞凋亡從而誘導上皮屏障損傷,細胞指數(Cell Index,CI)呈現下降趨勢。接下來,將體外提取的NETs于平臺期加入肺上皮屏障中也可觀測到類似的CI下降及細胞損傷效應。為進一步研究,活化的中性粒細胞對肺上皮細胞的毒副作用是否與其釋放NETs的能力有關,我們運用NADPH酶抑制劑DPI預處理中性粒細胞來阻滯NETosis過程,通過比較TCRPs發(fā)現,區(qū)別于LPS激活的中性粒細胞造成嚴重的肺上皮CI下降,DPI預處理的中性粒細胞對肺上皮的損傷效應明顯遏制,CI下降趨勢明顯緩解。由此,我們得出結論激活態(tài)中性粒細胞釋放NETs是其具有細胞毒作用的原因之一,且基于TCRPs的分析技術通過動態(tài)監(jiān)測肺上皮屏障的CI趨勢改變可以實時反映NETosis的誘導/阻滯進程。我們所建立的這種基于TCRPs的NETosis動態(tài)分析模型可以定性定量分析不同處理條件下或不同樣本來源的中性粒細胞所造成的上皮損傷效應的差異,從而分析其釋放NETs水平的不同。接下來我們想深入探究目前創(chuàng)建的這種方法是否在ALI的疾病診斷和治療上是否有臨床應用價值。ALI的主要病因是肺部炎癥和感染,因此我們選定的疾病人群是肺炎患者。通過比較靜脈血液樣本,我們發(fā)現,與健康對照組相比,重癥肺炎患者外周血中性粒細胞對肺上皮損傷更嚴重,造成的上皮CI下降趨勢更明顯,與其釋放NETs的能力更劇烈有關,這與其他常規(guī)的NETs檢測方法的驗證結果一致。中性粒細胞釋放NETs的能力與炎癥環(huán)境下中性粒細胞受到炎性刺激有關,因此我們嘗試檢測糖皮質激素及幾種常見非甾體抗炎藥物對NETosis 阻滯作用,TCRPs結果顯示阿司匹林和對乙酰氨基酚可顯著抑制NETs釋放,緩解中性粒細胞對肺上皮的損傷效應,與前人研究結果一致,進一步證明了基于微電子阻抗動態(tài)監(jiān)測NETosis體系的可行性,同時也表明我們所創(chuàng)建的NETosis動態(tài)分析模型具有潛在的臨床應用價值�？傊�,我們運用xCELLigence儀器基于TCRPs技術所建立的NETosis實時分析模型與傳統(tǒng)方法相比,具有無標記、動態(tài)連續(xù)、高通量的優(yōu)勢,為定性定量評估中性粒細胞以及中性粒細胞釋放的NETs對宿主肺上皮組織的損傷效應以及解釋ALI的發(fā)病機制提供了新的工具,且便于后續(xù)臨床開拓廣泛用于疾病診斷及篩選抑制NETs釋放的藥物,有助于推動ALI的治療進展。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R563
【圖文】：

本課題所采用的是ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ實時無標記細胞分析（ＲＴＣＡ）邋ＳＰ儀器（如逡逑圖１示），該系統(tǒng)配套的監(jiān)測組件是實時微電子撿測板，即一個底部整合有微電逡逑子芯片的Ｅ－９６孔板（如圖２示）。將儀器被放置于標準的Ｃ０２培養(yǎng)箝中，通過電逡逑纜接口與在外部的分析和控制單元進行連接，利用電子阻抗值來記錄細胞的行為逡逑變化，在屏幕實時顯示ＴＣＲＰｓ圖譜。逡逑ｒｍ逡逑通灥■逡逑■邐■■■■里蜃逡逑圖２．邋ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ實時無標記細胞分析儀邐圖３．邋Ｅ－ｐｌａｔｅ邋９６細胞培養(yǎng)板逡逑５逡逑

圖３．邋Ｅ－ｌａｔｅ邋９６細培板逡逑

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本文編號：2739353