【摘要】：【研究背景】 哮喘的臨床特征表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性和氣道黏液高分泌，慢性非特異性氣道炎癥是哮喘重要的發(fā)病機制。黏液高分泌是哮喘患者肺功能下降，以及致死性哮喘發(fā)生的因素之一，但目前臨床尚缺乏抑制黏液高分泌的手段。氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量增多是黏液高分泌的病理基礎(chǔ)，探討杯狀細(xì)胞的病變機制是控制該臨床癥狀的突破口。已有的研究證實，人鈣激活氯離子通道I型（human calcium-activated chloridechannel1，hCLCA1）作為新生杯狀細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白，通過調(diào)控黏蛋白5AC（Mucin5AC,MUC5AC）的合成，在氣道黏液合成及分泌過程中扮演了重要角色。hCLCA1和小鼠鈣激活氯離子通道III型Murine calcium-activated chloride channel type3,mCLCA3)是異種同源蛋白，分別在各自的物種氣道黏液高分泌中起著關(guān)鍵作用。早期人們認(rèn)為它們是一種跨膜通道離子蛋白，但近年國外的研究小組發(fā)現(xiàn)，mCLCA3和hCLCA1是分泌型蛋白，可以自裂解為N端的75kD和C端的35kD的兩個獨立結(jié)構(gòu)，可能N端能作為獨立的個體行使全長的功能，通過對膜氯離子通道蛋白的調(diào)控作用，來實現(xiàn)對黏液蛋白合成與分泌的調(diào)節(jié)。同時，鈣激活氯離子通道（Calcium-activated chloride channel，CLCA）與氣道炎癥的形成也存在密切的關(guān)系，甚至可能互為因果。體外表達(dá)和純化hCLCA1是進(jìn)一步研究該蛋白功能的基礎(chǔ)和前提，同時，進(jìn)一步驗證hCLCA1的存在形式有利于揭示該蛋白的作用機制。 【目的】 觀察hCLCA1在離體的上皮細(xì)胞模型NCI-H292細(xì)胞中的表達(dá)及分泌情況，探討hCLCA1作為氣道炎癥介質(zhì)的可能性。本課題組前期的動物實驗已經(jīng)證實mCLCA3對小鼠哮喘模型的炎癥及黏液分泌具有促進(jìn)作用，mCLCA3的抗體可以阻斷哮喘小鼠模型的炎癥進(jìn)程，對炎癥的發(fā)展有一定的阻斷作用。本實驗對mCLCA3的異種同源蛋白hCLCA1的N端的蛋白在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行了其N端功能結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白純化及鑒定，為進(jìn)行下一步的蛋白功能研究做準(zhǔn)備。通過將hCLCA1過表達(dá)慢病毒感染NCI-H292后，收集上清及細(xì)胞沉淀，進(jìn)行western blotting驗證，觀察hCLCA1在離體人上皮細(xì)胞中的合成及自裂解，為hCLCA1在人氣道黏液高分泌癥狀中扮演的角色進(jìn)行初步研究。 【方法與結(jié)果】 1．成功構(gòu)建hCLCA1全長的真核及N端的原核質(zhì)粒。⑴將N端約2200bp目的片段插入pET28a載體，用SalI及Xhol1對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，得到大小為2200bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。測序表明重組質(zhì)粒pET28a(+)/hCLCA1-N構(gòu)建成功。⑵將hCLCA1全長基因約2935bp目的片段插入pEGFP-N1載體，用SalI及BglII對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，得到大小為2935bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。測序重組質(zhì)粒EGFP-N1(+)/hCLCA1構(gòu)建成功，可以進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)染試驗。⑶利用轉(zhuǎn)染試劑Tuberfect在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染EGFP-N1(+)/hCLCA1重組質(zhì)粒，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不同時間觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示hCLCA1可以在NCI-H293細(xì)胞中成功表達(dá)。24h后取出細(xì)胞爬片，利用DAPI進(jìn)行核染色觀察細(xì)胞定位。結(jié)果顯示GPF-hCLCA1在細(xì)胞核周圍的細(xì)胞器中表達(dá)量較高。 2．hCLCA1-N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定。⑴誘導(dǎo)pET28a(+)/hCLCA1-N轉(zhuǎn)化的BL21菌株，經(jīng)篩選獲得最佳表達(dá)時間（5h）、溫度（30℃）、濃度（0.5mmoL/L）。⑵以最佳條件進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，在冰上進(jìn)行充分的超聲裂解，分別對收集到的上清、沉淀樣品進(jìn)行凝膠電泳檢測。實驗表明，我們的目的蛋白大多數(shù)存在沉淀樣品中，約占80％。⑶對蛋白進(jìn)行His鎳柱純化，SDS-PAGE電泳顯示獲得純度較高的目的蛋白, Western blotting在70kD分子量大小附近有一條明顯條帶；而在未誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白中無該條帶。結(jié)果顯示，所純化的Hish-hCLCA1-N融合蛋白正確，為下一步實驗的hCLCA1的單克隆抗體制備及后續(xù)的抗體干預(yù)細(xì)胞功能提供了條件。 3．對hCLCA1進(jìn)行了慢病毒載體的包裝并感染NCI-H292細(xì)胞。⑴將慢病毒包裝輔助質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑Turbofect轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，免疫熒光結(jié)果顯示48h后HEK293細(xì)胞的表達(dá)情況良好，轉(zhuǎn)染效率較高。⑵收集病毒上清，感染NCI-H292細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞及上清做Western Blotting檢測，結(jié)果顯示在細(xì)胞上清中可以檢測到60KD的蛋白，在細(xì)胞中檢測到60KD及130KD左右的蛋白，去除EGFP片段大小后說明hCLCA1蛋白可以在NCI-H292細(xì)胞內(nèi)自裂解為N端和C端兩個獨立結(jié)構(gòu)。這為后期將分泌的上清蛋白進(jìn)行上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的趨化及黏附功能的研究打下基礎(chǔ)。 【結(jié)論】 1．本實驗合成了人的hCLCA1-N段胞外活性肽段，進(jìn)行了蛋白的原核表達(dá)和純化，為后期針對人hCLCA1的抗原合成打下了基礎(chǔ)。 2．為了觀察hCLCA1在上皮細(xì)胞中的合成及其是否在胞內(nèi)裂解且分泌到胞外，我們對hCLCA1進(jìn)行病毒載體包裝后感染NCI-H292細(xì)胞，感染效率高，約為60%以上。 3.在用病毒包裝載體感染NCI-H292細(xì)胞后，進(jìn)行了蛋白細(xì)胞內(nèi)的定位，發(fā)現(xiàn)hCLCA1可以在人呼吸道上皮細(xì)胞的體外模型中發(fā)生自裂解，且能分泌到細(xì)胞外起作用，可能會在哮喘呼吸道上皮的非特異性炎癥起一定的作用。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳文麗;甄宏韜;崔永華;褚漢啟;王麗芬;;鈣激活氯通道和黏蛋白在變應(yīng)性鼻炎中的表達(dá)與意義[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2010年05期

本文編號：2738312