發(fā)布時間：2020-07-02 04:14

【摘要】： 研究背景及目的： 以急性肺部感染為主的感染所致的肺損傷仍然是急性肺損傷發(fā)病的最重要，最常見因素。其中以脂多糖所致炎癥性肺損傷為多見，目前尚缺乏十分有效的輔助治療手段。我國目前缺乏大樣本的相關(guān)的流行病學(xué)資料，上海市12家大學(xué)附屬醫(yī)院的15個ICU的為期1年的前瞻性研究顯示，ALI／ARDS的最常見患病因素為肺炎(34.3％)和肺外敗血癥(30.6％)，且樣本中患者90天死亡率達到70.4％，足見感染性肺損傷的多發(fā)性和嚴重性。本課題設(shè)想將間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSC)載體，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使其攜帶促血管生成素1(Agiopoietin-1，Ang1)基因，回輸體內(nèi)進行干預(yù)脂多糖(LPS)所致的肺損傷模型，充分利用基因治療與干細胞治療的優(yōu)點，有效干預(yù)LPS所致肺損傷。 方法： 采用MSCs分離、培養(yǎng)和擴增至第4代，經(jīng)流式細胞儀鑒定，得到純度較高的MSCs。同時以三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法在293T細胞中制備病毒顆粒Lenti-Ang1和Lenti-EGFP，并轉(zhuǎn)染MSCs，通過試驗確定轉(zhuǎn)染的最佳M.O.I.和最佳時間，并通過RT-PCR和western-blot檢測轉(zhuǎn)染后MSCs中Ang1的基因和蛋白表達，確定轉(zhuǎn)染成功。以脂多糖霧化吸入的方式誘導(dǎo)小鼠炎癥性肺損傷模型，設(shè)未處理組為對照組，設(shè)三組干預(yù)組，包括：攜帶Ang1的MSCs組(MSC-Ang1組)，單純Ang1組(Ang1組)和單純MSCs組(MSC組)。觀察并記錄生存天數(shù)，計算生存率；提取肺組織總蛋白并用western blot方法檢測Ang1蛋白的表達；測定肺部炎癥和損傷指標包括肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性和肺濕干比，實時熒光定量RT-PCR檢測肺組織中TNF-.的mRNA含量；光鏡觀察肺組織病理學(xué)改變并進行評估；熒光顯微鏡檢測肺組織中外源MSCs攜帶的eGFP所發(fā)熒光，免疫組化雙染色進行外源細胞的定位，確定外源MSCs源性細胞在肺部的表現(xiàn)。 結(jié)果： 1．改良的Peister法能成功分離培養(yǎng)到符合實驗需要的較高純度的MSCs。 2．通過Lentiviral載體系統(tǒng)，Ang1可轉(zhuǎn)染MSCs并在其中穩(wěn)定表達。其最佳MOI為20，最佳時間為第5天，轉(zhuǎn)染效率在90％以上。 3．CD44，Sca-1，CD31和CD45等MSCs的重要表面標記，在轉(zhuǎn)染前后未見明顯改變，提示轉(zhuǎn)染Ang1不影響MSCs的細胞表型及特性。 4．MSCs本身微量表達Ang1，而轉(zhuǎn)染外源基因Ang1后，MSCs中Ang1的mRNA和蛋白表達量明顯上升。經(jīng)多重純化后，流式細胞儀鑒定獲得的干細胞為CD44(+)，Sca-1(+)，CD31(-)和CD45(-)的MSCs，純度在90％以上。 5．在第14天可見肺組織受損處多處表達GFP的細胞出現(xiàn)，根據(jù)其形態(tài)可判定為肺泡上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞，在肺損傷較重的部位表達GFP的細胞數(shù)量相對較多。 6．對Ang1在體內(nèi)表達的檢測顯示對照組Ang1蛋白在脂多糖誘導(dǎo)肺損傷后呈下降趨勢，直至14d仍然低于肺損傷前，而MSC-Ang1組第3天下降明顯，但隨后回升，至第14天已恢復(fù)并高于損傷前水平。 7．MSC-Ang1組在第14天的MPO活性和肺濕干比較其它三組明顯降低，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，提示Ang1的轉(zhuǎn)入有效減低肺組織MPO的激活和肺水腫。 8．肺組織病理學(xué)及其評分顯示，與對照組比較，MSC-Ang1組在改善肺組織病理損傷總評分上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而另二組無統(tǒng)計學(xué)差異。 9．MSC-Ang1生存率高于對照組，生存率分析顯示存在一定優(yōu)勢，但尚未達到統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.066)。 結(jié)論： 1．MSCs可成功分離提純，并可經(jīng)由Lentivirus系統(tǒng)高效率、長時間穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，使其攜帶Ang1基因，且MSCs本身主要表面標志不受影響。MSCs是良好的基因治療運載工具。 2．攜帶目的基因Ang1的MSCs在輸入體內(nèi)后，Ang1與MSCs發(fā)揮協(xié)同作用，Ang1肺內(nèi)高表達，發(fā)揮其抗炎和穩(wěn)定血管減輕滲漏的作用，同時MSCs通過轉(zhuǎn)化或融合，修復(fù)肺部上皮或內(nèi)皮細胞。MSCs細胞介導(dǎo)的Ang1基因治療不失為一種可行性的干預(yù)炎癥性肺損傷的方法。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R563.8
【圖文】：

2)感受態(tài)的制備接種ZmL過夜培養(yǎng)的菌液到200mLLB培養(yǎng)基中。37℃250r/而n振蕩養(yǎng)至OD55。二0.5;轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液到離心管中，立即放入冰浴中，輕輕旋轉(zhuǎn)至完全卻。4℃50O0r/而n離心10而n。菌體沉淀重懸于100mL用冰預(yù)冷的氯化鎂溶中;冰浴中放置5而n，4℃4000r/而n離心10而n。然后重懸于100mL用冰冷的氯化鈣溶液中，冰浴20而n。4℃4000r/min離心10而n。重懸于20mL化鈣/甘油溶液。最后將感受態(tài)細胞分裝并儲藏于一70℃。3)pcR2.1一Angl質(zhì)粒DNA的大量抽提流程:過過夜培養(yǎng)(37℃，23or/min培養(yǎng)12一14h)的soom一比培養(yǎng)液液444000r/而n離心10min，棄上清，倒置離心管管口于濾紙上，流盡全部上清

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【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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3 何禮賢;;醫(yī)院獲得性肺炎的發(fā)病機制及防治[J];中華全科醫(yī)師雜志;2006年10期

本文編號：2737726