【摘要】： 目的:急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床常見的由感染等多種因素引起的彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷,也是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)或多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)在肺部的典型表現(xiàn)。ALI的發(fā)病的機(jī)制很復(fù)雜,迄今為止尚未完全闡明。以往的研究已證明,ALI的發(fā)生與機(jī)體肺部氧化/抗氧化平衡失調(diào)有直接關(guān)系,因?yàn)楫?dāng)肺臟受到各種致病因素(如創(chuàng)傷、休克、感染等)嚴(yán)重打擊時(shí),可導(dǎo)致肺臟局部產(chǎn)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而引起ALI。革蘭氏陰性菌是臨床引起氣道和肺部炎癥的重要病原之一,其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分介導(dǎo)炎癥細(xì)胞如肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等釋放大量的促炎因子、炎性介質(zhì),此過程在炎癥反應(yīng)中起重要作用。然而,在炎癥反應(yīng)過程中,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用。 促分裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase,MAPK)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物信號(hào)引起核反應(yīng)的重要通路,其家族主要有細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-jun氨基未端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)、p38MAPK和ERK-5。其中p38MAPK信號(hào)通路與ALI關(guān)系密切,是參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)的重要通路,p38MAPK通過非磷酸化轉(zhuǎn)化為磷酸化狀2態(tài)進(jìn)而促進(jìn)下游底物的磷酸化以實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),啟動(dòng)核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子,從而促進(jìn)炎癥介質(zhì)分泌,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。但是,關(guān)于p38MAPK信號(hào)通路活化及上游調(diào)控機(jī)制仍不清楚。 實(shí)驗(yàn)表明, p38MAPK通路對(duì)機(jī)體有保護(hù)性作用。但由于TNF-α、IL-1持續(xù)高水平而導(dǎo)致的炎性過程可能同p38MAPK的過度激活有關(guān),尤其在LPS誘導(dǎo)的多種細(xì)胞因子合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到關(guān)鍵性作用。Beaty等實(shí)驗(yàn)表明p38MAPK途徑介導(dǎo)了LPS作用的中性粒細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), p38MAPK在LPS作用下被磷酸化活化,活化的p38MAPK即由胞漿進(jìn)入胞核,轉(zhuǎn)錄生成大量的炎性因子。有研究已證明抑制p38MAPK途徑,能夠有效的抑制炎癥反應(yīng),明顯的減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)。褪黑素是已發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)抗氧化應(yīng)激作用的激素,但其作用與p38MAPK途徑是否相關(guān),國(guó)內(nèi)外無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,其機(jī)制尚有待研究。 褪黑素最早認(rèn)為對(duì)機(jī)體的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、精神神經(jīng)系統(tǒng)和生物節(jié)律等都有明顯的調(diào)節(jié)作用,同時(shí)與睡眠、鎮(zhèn)靜等生物學(xué)行為有關(guān)。直到20世紀(jì)90年代初,Tan等首次報(bào)道MT具有抗氧化活性,是一種高效的內(nèi)源性自由基清除劑,并在抗炎方面有積極的作用,所以,MT抗ALI機(jī)制研究仍然是目前的熱點(diǎn)。但是,MT抗氧化抗炎作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生理水平MT在機(jī)體抗氧化抗炎防御體系中的地位和機(jī)制到目前仍未弄清楚,所以從分子水平去解決上述問題,為MT的廣泛應(yīng)用開辟更為廣闊的前景。本課題通過氣管內(nèi)滴注LPS復(fù)制大鼠ALI模型,旨在在體實(shí)驗(yàn)探討ALI和p38MAPK信號(hào)通路活化的關(guān)系及MT抗ALI機(jī)制,為MT的臨床應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:本實(shí)驗(yàn)采用氣管內(nèi)滴注LPS復(fù)制大鼠ALI模型,并通過腹腔給予MT,觀察不同時(shí)間點(diǎn)丙二醛(malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮(nitrogen monoxidum, NO)、肺組織病理學(xué)改變及肺組織中p38MAPK蛋白的表達(dá)變化。 將72只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重190~220克,隨機(jī)分為3組,每組24只。①Control組:經(jīng)氣管滴注無熱源生理鹽水(NS),每只200μl,并在滴注前后30min分別腹腔注射(ip)溶媒(1%乙醇生理鹽水)1ml/kg;②LPS組:經(jīng)氣管滴注LPS(200μg/200μl/只),并在滴注前后30min分別ip溶媒1ml/kg;③LPS+MT組:經(jīng)氣管滴注LPS(200μg/200μl/只),并在滴注前后30min分別ip MT 10mg/kg。各組動(dòng)物分別于滴注LPS后3h、6h和10h經(jīng)頸總動(dòng)脈放血處死,同時(shí)留取肺部標(biāo)本。肺部標(biāo)本分為三部分:一部分制備勻漿檢測(cè)MDA、SOD、NO的活性和含量變化;一部分觀察其形態(tài)學(xué)變化,同時(shí)采用免疫組織化學(xué)染色和圖像分析觀察肺組織中p38MAPK蛋白的表達(dá)和分布;另一部分勻漿采用Western blot技術(shù)觀察肺組織中p38MAPK蛋白的表達(dá)變化。 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示,組間差異用單因素方差分析(one way ANOVA),有顯著差異者用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,均以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:1肺組織中MDA含量的變化:與Control組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,LPS組經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和10h肺組織中MDA含量顯著升高(P均0.01),且10h時(shí)達(dá)到高峰,相鄰時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(P均0.01);與LPS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,LPS+MT組肺組織MDA含量明顯降低(P均0.01),但仍高于Control組(P均0.01)。 2肺組織中SOD活性的變化:與Control組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,LPS組經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和10h肺組織中SOD活性顯著降低(P均0.01),且10h時(shí)活性降到最低,相鄰時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(P均0.01);與LPS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,LPS+MT組肺組織SOD活性明顯升高(P均0.01),但仍低于Control組(P均0.01)。 3肺組織中NO含量的變化:與Control組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,LPS組經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后3h、6h和10h肺組織中NO含量顯著升高(P均0.01),且10h時(shí)達(dá)到高峰,相鄰時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(P均0.01);與LPS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較,LPS+MT組肺組織NO含量明顯降低(P均0.01),但仍高于Control組(P均0.01)。 4肺組織形態(tài)學(xué)觀察:Control組肺泡結(jié)構(gòu)清晰,壁薄,肺泡腔內(nèi)無滲出液;滴注LPS后3h肺泡間隔明顯增厚,肺泡萎陷及炎細(xì)胞浸潤(rùn),6h時(shí)其結(jié)構(gòu)已無法辨認(rèn),10h時(shí)改變更加顯著;LPS+MT組3h改變同Control組,6h與10h時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)仍然存在,肺泡間隔略增厚,PMN浸潤(rùn)較LPS組明顯減輕,肺泡腔內(nèi)滲出不明顯,但個(gè)別區(qū)域炎癥改變較突出。 5肺組織免疫組織化學(xué)染色觀察:Control組氣道和肺組織可見反應(yīng)較弱的p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞,LPS組p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多(10h時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰,P0.05或P0.01),主要分布于浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。LPS+MT組氣道和肺組織中陽(yáng)性細(xì)胞分布與LPS組類似,但陽(yáng)性信號(hào)明顯減弱(10h時(shí)P均0.01)。 6肺組織Western blot分析發(fā)現(xiàn):Control組可見肺組織p38MAPK蛋白有少量表達(dá)。LPS組各時(shí)間點(diǎn)與Control組相比,p38MAPK蛋白表達(dá)顯著升高,10h時(shí)達(dá)到高峰,表現(xiàn)為p38MAPK與β-actin的IOD值的比值升高(P0.05或P0.01)。LPS+MT組各時(shí)間點(diǎn)與LPS組相比,p38MAPK蛋白表達(dá)下降,表現(xiàn)為p38MAPK與β-actin的IOD值的比值下降(P均0.05),但仍高于Control組。 結(jié)論:1氣管內(nèi)滴注LPS可引起大鼠肺組織嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),說明成功地復(fù)制了ALI動(dòng)物模型。 2 LPS誘發(fā)的大鼠急性肺損傷模型中,磷酸化p38MAPK在氣道和肺組織內(nèi)表達(dá)增加, p38MAPK的活化見于肺組織內(nèi)多數(shù)細(xì)胞,提示肺內(nèi)炎性和非炎性細(xì)胞均有p38MAPK信號(hào)分子的激活。 3 MT對(duì)ALI時(shí)的肺臟起明顯的保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制可能與MT的抗氧化作用和抑制p38MAPK信號(hào)通路的過度激活有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2734137